体外细胞增殖实验
评估高浓度BCAA及其组分（异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）对多种癌细胞增殖的影响。
将NSCLC（A549、H1975）、乳腺癌（4T1）、肝癌（Hepa1-6）、结肠癌（CT26）和肾细胞癌（786-O）细胞培养在含不同浓度BCAA（25x、50x、75x）的培养基中，使用CCK-8法检测2、4、6天的增殖曲线。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
高剂量异亮氨酸稳定核PTEN抑制肺癌增殖
High dose isoleucine stabilizes nuclear PTEN to suppress the proliferation of lung cancer.
实验完整度
高包含体外细胞增殖实验、小鼠移植瘤模型、转录组分析、Western blot、免疫共沉淀、PTEN敲除/敲低/过表达功能验证及机制研究。
主要模型
非小细胞肺癌细胞系A549、H1975 小鼠LLC移植瘤模型 PTEN敲除的A549和LLC细胞系 IARS1敲低的A549细胞系
重点核对
BCAA补充浓度：50倍、75倍于标准培养基 异亮氨酸给药剂量：300 mg/kg（小鼠） BCAA给药剂量：900 mg/kg（小鼠） mTORC1抑制剂雷帕霉素浓度：50 nM（体外）和1 mg/kg（体内） PTEN和IARS1基因敲除/敲低细胞系的构建
摘要
目的：癌细胞需要氨基酸供应，特别是必需氨基酸如支链氨基酸（BCAAs，即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸），以满足恶性肿瘤增加的营养需求。改变的BCAA供应的细胞自主和非自主作用与癌症进展有关。参与BCAA摄取、转运、代谢等过程的关键蛋白可作为人类癌症的潜在治疗生物标志物。在此，我们通过探索肿瘤中BCAA供应增加引发的连锁反应，总结了BCAA的潜在抗肿瘤机制。方法：采用系统级策略，基于全面的组学、分子实验和数据分析，为建立BCAA与癌症之间的联系提供通用解决方案。结果：BCAA过量补充（900 mg/kg）显著抑制肿瘤生长并减少肿瘤负担，其中异亮氨酸的效果最为显著。令人惊讶的是，异亮氨酸抑制肿瘤生长不依赖于mTORC1的激活，而mTORC1是经典的氨基酸传感器。探索性转录组分析显示，磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）是异亮氨酸抗肿瘤作用的关键因子。通过抑制PTEN泛素化，异亮氨酸能促进PTEN核输入并维持PTEN核稳定性。有趣的是，这一过程受异亮氨酸-tRNA连接酶（细胞质）（IARS）调控，而IARS是异亮氨酸的直接靶标。我们证明了在过量异亮氨酸存在下IARS与PTEN之间的相互作用增强。同时，IARS敲除导致异亮氨酸肿瘤抑制能力丧失。结论：总体而言，我们的结果提供了异亮氨酸调控IARS-PTEN抗肿瘤轴的见解，并揭示了一种基于增强细胞异亮氨酸供应的独特治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究过量支链氨基酸（尤其是异亮氨酸）对肺癌生长的影响及其潜在的抗肿瘤机制。
- 核心机制
- 异亮氨酸通过增强IARS1与PTEN的相互作用，促进PTEN核输入并减少其泛素化，维持核PTEN稳定性，从而激活PTEN介导的转录调控，抑制肿瘤生长，且不依赖于mTORC1通路。
- 主要证据
- 体外细胞增殖实验显示高浓度BCAA抑制多种癌细胞增殖；小鼠移植瘤模型证实异亮氨酸抑制LLC肿瘤生长；PTEN敲除和敲低细胞系及异亮氨酸处理实验显示PTEN是异亮氨酸抗肿瘤作用的关键；免疫共沉淀和免疫荧光证实IARS1与PTEN相互作用并在异亮氨酸作用下增强，IARS1敲低导致异亮氨酸抗增殖能力丧失。
- 研究意义
- 该研究揭示异亮氨酸通过IARS-PTEN轴发挥抗肿瘤作用的新机制，为基于增强细胞异亮氨酸供应的肿瘤治疗策略提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内移植瘤实验
验证过量BCAA及其组分对小鼠肿瘤生长的抑制作用。
建立LLC、CT26、4T1、B16F10细胞系的小鼠移植瘤模型，每天腹腔注射BCAA（900 mg/kg）或单个氨基酸（300 mg/kg），测量肿瘤大小和重量。
转录组分析
识别异亮氨酸处理肿瘤组织中差异表达基因及关键转录因子。
对异亮氨酸处理的LLC肿瘤组织进行RNA-seq，通过DESeq2分析差异表达基因，使用KnockTF进行转录因子富集分析，并使用GOBP富集分析。
PTEN功能验证
验证PTEN在异亮氨酸抗肿瘤作用中的必要性。
构建PTEN敲低和敲除的A549和LLC细胞系，以及过表达PTEN的A549细胞系，检测异亮氨酸处理后的增殖变化和体内成瘤能力。
PTEN核定位和稳定性分析
验证异亮氨酸对PTEN核输入和泛素化的影响。
使用核质分离、免疫荧光和免疫共沉淀检测异亮氨酸处理后PTEN的核定位和泛素化水平，并检测相关泛素化酶表达变化。
IARS1与PTEN相互作用分析
探究异亮氨酸是否通过增强IARS1与PTEN的相互作用促进PTEN核输入。
通过免疫共沉淀、质谱分析、免疫荧光共定位和亚细胞分级实验检测IARS1与PTEN的相互作用，并构建IARS1敲低细胞系验证其对异亮氨酸抗增殖效应的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | 10099141 | |
| 青霉素混合物 | -- | P1400 | |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | 上海源叶 | B20714 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8细胞增殖检测试剂盒 | -- | -- |
| Western blot | QProteome哺乳动物蛋白制备试剂盒 | Qiagen | -- |
| NE-PER核和细胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| Pierce ECL化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| Xfect转染试剂盒 | -- | 631317 | |
| 基因敲除 | EnGen Sau Cas9核酸酶 | NEB | M0654S |
| 病毒包装 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
| 质粒提取 | 无内毒素大提质粒试剂盒 | -- | D6926 |
| RT-qPCR | TaKaRa MiniBEST通用RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）+ ROX plus | Takara | -- | |
| Western blot | 抗PTEN抗体（D4.3）XP兔单抗 | Cell Signaling Technology | 9188 |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| 抗FLAG标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 磷酸化p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| PTEN多克隆抗体 | Proteintech | 22034-1-AP | |
| IARS多克隆抗体 | Proteintech | 26942-1-AP | |
| 抗IARS2抗体 | Proteintech | 17170-1-AP | |
| WWP2多克隆抗体 | Proteintech | 12197-1-AP | |
| USP7多克隆抗体 | Proteintech | 26948-1-AP | |
| USP13多克隆抗体 | Proteintech | 16840-1-AP | |
| FBXO22多克隆抗体 | Proteintech | 13606-1-AP | |
| 抗IARS抗体 | Abcam | ab31533 | |
| 兔抗小鼠IgG H&L二抗 | Abcam | ab6728 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 抗WWP1抗体 | Abcam | ab43791 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| 抗Cdk4抗体 | Abcam | ab199728 | |
| 抗DMRT1抗体 | Abcam | ab222895 | |
| PTEN单克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-12278 | |
| α-微管蛋白抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | |
| 抗Nedd4抗体 | MilliporeSigma | -- | |
| 药物处理 | L-异亮氨酸 | 上海源叶 | S20042 |
| L-亮氨酸 | 上海源叶 | S20044 | |
| L-缬氨酸 | 上海源叶 | S20117 | |
| 质粒构建 | FLAG/hPTEN过表达质粒 | VectorBuilder | VB201207-1204wbw |
| FLAG/hIARS1过表达质粒 | VectorBuilder | VB200810-1690bab | |
| hPTEN过表达质粒 | VectorBuilder | VB900005-2059vze | |
| hIARS敲低质粒 | VectorBuilder | VB900047-2368gnu | |
| hPTEN敲低质粒 | VectorBuilder | VB900058-2697amv | |
| FLAG/hPTEN过表达质粒 | VectorBuilder | VB210506-1296xka | |
| hPTEN过表达质粒 | VectorBuilder | VB210408-1024xgy | |
| hPTEN突变体过表达质粒 | VectorBuilder | VB210408-1026qmu | |
| 乱序对照shRNA质粒 | VectorBuilder | VB010000-0009mxc | |
| pCMV-VSV-G包装质粒 | Addgene | 8454 | |
| pCMV-dR8.2 dvpr包装质粒 | Addgene | 8455 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞增殖实验 | BCAA浓度（25x、50x、75x）的具体配制，细胞密度（每孔3×10^3），培养时间（2、4、6天），CCK-8试剂用量（10 μl/孔）及孵育时间（2小时）。 阅读提示：Methods：Cell proliferation experiment |
| 异亮氨酸处理 | 体外处理浓度（本研究中常用50×），处理时间（12小时、48小时等），体内给药剂量（300 mg/kg），给药方式（腹腔注射）。 阅读提示：Methods：Cell proliferation experiment、Animal experiment、Results图注（Fig. 3、4、5） |
| PTEN敲除/敲低细胞系构建 | sgRNA序列（人PTEN、小鼠Pten），Cas9转染方法（电穿孔），筛选方法（有限稀释法），鉴定方法（PCR扩增测序、Western blot）。 阅读提示：Methods：Construction of knockdown or overexpression cell lines、Cell construction for knocking out PTEN |
| 免疫共沉淀 | 使用的抗体（抗PTEN、抗Flag），裂解液和洗涤条件，磁珠类型（蛋白A免疫磁珠），样品制备和检测方法。 阅读提示：Methods：Co-immunoprecipitation and Nano-LC–ESI–MS/MS analysis |
| 小鼠移植瘤模型 | 细胞接种量（5×10^5），小鼠品系和性别（C57BL/6雄性用于LLC和B16F10，BALB/c雌性用于4T1和CT26），给药开始时间（第三天），给药剂量（BCAA 900 mg/kg，异亮氨酸300 mg/kg），肿瘤测量频率（每2天），伦理最高肿瘤大小（<2 cm）。 阅读提示：Methods：Animal experiment |