vsmCISH工作流程建立与特异性验证
验证基于V探针的vsmCISH方法能否特异性地检测目标RNA。
在PGR阳性/阴性细胞系（T47D/MCF-7）和HPV-18阳性/阴性细胞系（HeLa/A549）中检测PGR mRNA和HPV-18 E6/E7 mRNA，统计无信号细胞比例。
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通过vsmCISH在临床FFPE组织切片中进行单分子RNA原位检测
Single-molecule RNA in situ detection in clinical FFPE tissue sections by vsmCISH.
实验完整度
高包含细胞系验证、临床FFPE样本检测、方法学比较（与smCISH、RollFISH）、外部对照建立及定量分析，涵盖体外和临床样本多个独立证据层级，并有功能验证。
主要模型
细胞系：MCF-7、T47D、HeLa、A549、HepG2、SK-BR-3 FFPE组织切片：浸润性乳腺癌 FFPE组织切片：肝细胞癌、结直肠癌、结肠癌肝转移
重点核对
细胞系模型与阴性对照细胞系的选择 V探针与环状探针前体之间的碱基配对长度（8-9个碱基） RCA反应时间（2小时）及反应温度（42°C） 临床样本来源及伦理审批（伦理批准号M2021005） HER2 mRNA评分系统（五级评分）
摘要
尽管RNA在基因表达中起着至关重要的作用，但作为临床诊断的原位生物标志物，其使用频率低于DNA和蛋白质。这主要是由于RNA分子表达水平低且易降解所带来的技术挑战。为了解决这一问题，需要灵敏且特异的方法。在此，我们提出一种基于DNA探针邻近连接和滚环扩增的RNA单分子显色原位杂交检测方法。当DNA探针与RNA分子杂交到邻近位置时，它们形成V形结构并介导环状探针的环化。因此，我们的方法被称为vsmCISH。我们成功地将该方法应用于评估浸润性乳腺癌中HER2 mRNA的表达状态，并研究了白蛋白mRNA ISH在区分原发性肝癌和转移性肝癌中的效用。在临床样本上取得的令人鼓舞的结果表明，我们的方法在使用RNA生物标志物诊断疾病方面具有巨大的应用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种灵敏、特异的RNA单分子原位检测方法，并评估其在临床FFPE组织样本中检测RNA生物标志物的潜力。
- 核心机制
- 基于DNA探针邻近连接形成V形结构，介导环状探针环化，并通过滚环扩增增强信号，从而实现对单个RNA分子的特异性检测。
- 主要证据
- 在多个细胞系中验证了特异性（如PGR、HPV-18、ESR1、HER2、ALB）；与smCISH比较显示更高的检测效率和更大的RCPs；在临床FFPE样本中成功检测HER2 mRNA，且与IHC和FISH结果具有良好一致性。
- 研究意义
- vsmCISH具有成为使用RNA生物标志物进行临床诊断的有用分子诊断工具的潜力，尤其在HER2低表达乳腺癌分层和区分原发性与转移性肝癌方面。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
V探针与环状探针前体碱基配对长度优化
确定V探针与环状探针前体之间的最佳碱基配对长度。
设计三组ESR1探针，配对长度分别为8/9、13和18个碱基，在MCF-7细胞中检测ESR1 mRNA，比较每个细胞的RCP数量。
与smCISH检测效率比较
评估vsmCISH是否比基于挂锁探针的smCISH具有更高的检测效率。
在MCF-7和A549细胞中，使用5个杂交位点和单一位点比较vsmCISH与smCISH检测ESR1 mRNA的效率。
RCA效率评估
比较vsmCISH与smCISH的滚环扩增效率（通过RCP尺寸反映）。
在MCF-7细胞中检测HER2 mRNA，进行2小时RCA，测量RCP面积。
外部阴性和阳性对照建立
为临床FFPE检测建立合适的阳性和阴性外部对照。
在MCF-7细胞和正常乳腺FFPE组织中检测细菌dapB基因（阴性对照）和三个管家基因（PPIB、TPT1、GAPDH，阳性对照），并与HPA数据库表达趋势比较。
ALB mRNA检测在肝癌诊断中的应用
探讨vsmCISH检测白蛋白mRNA在区分原发性肝癌和转移性肝癌中的效用。
在HepG2细胞、SK-BR-3细胞和临床FFPE样本（肝细胞癌、结直肠癌、结肠癌肝转移）中检测ALB mRNA。
HER2 mRNA检测在浸润性乳腺癌中的应用
评估vsmCISH检测HER2 mRNA表达并与IHC和FISH结果的相关性。
在30例浸润性乳腺癌FFPE切片中进行HER2 mRNA检测，并定量单个细胞水平（至少50个浸润癌细胞），建立五级评分系统并与IHC和FISH结果比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Shanghai Basalmedia Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141C | |
| RPMI 1640培养基 | Shanghai Basalmedia Technologies | -- | |
| MEM培养基（含非必需氨基酸） | Procell | PM150410 | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Shanghai Basalmedia Technologies | S330JV | |
| 粘附显微镜载玻片 | Citotest | 188105 | |
| EasYDish培养皿 | Nunc, Thermo Scientific | 150468 | |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| FFPE组织预处理 | 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7012 |
| 探针杂交 | ImmEdge疏水屏障笔 | Vector | H-4000 |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 增强型内源性过氧化物酶封闭液 | Beyotime | P0100B | |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| 柠檬酸钠缓冲液 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| 环状探针前体杂交与连接 | 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 |
| 牛血清白蛋白 | Sangon | B600036 | |
| RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Scientific | EO0381 | |
| 三磷酸腺苷 | Thermo Scientific | R0441 | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Scientific | EL0011 | |
| RCA | 甘油 | Sigma-Aldrich | G9012 |
| 脱氧核苷三磷酸 | Thermo Scientific | R0182 | |
| EquiPhi29 DNA聚合酶 | Thermo Scientific | A39391 | |
| 染色与封片 | DAB免疫组织化学显色试剂盒 | BBI Life Sciences | E670033 |
| 中性树胶封片剂 | BBI Life Sciences | E675007 | |
| 图像采集 | 徕卡DM6B显微镜 | Leica | -- |
| DFC7000T相机 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基类型、FBS浓度、细胞系来源、培养条件（37°C，5% CO2）、细胞密度（约80%）、固定条件（4% PFA 30分钟） 阅读提示：详见Materials and Methods中的Cell culture and sample preparation |
| FFPE组织预处理 | 烤片温度和时间（60°C 30分钟）、脱蜡和复水步骤、胃蛋白酶消化条件（0.1 M HCl含0.1 mg/mL pepsin，37°C 30分钟）、固定步骤 阅读提示：详见Materials and Methods中的Pretreatment steps of FFPE tissue sections |
| 探针杂交 | V探针浓度（100 nM）、杂交缓冲液（15% formamide，6× SSC）、杂交温度和时间（37°C 2小时）、洗涤条件 阅读提示：详见Materials and Methods中的V probe hybridization |
| 连接反应 | 环状探针前体浓度（100 nM）、T4 DNA连接酶浓度（0.05 Weiss U/µL）、连接条件（37°C 0.5小时） 阅读提示：详见Materials and Methods中的Circle probe precursors' hybridization and ligation |
| RCA | EquiPhi29 DNA聚合酶浓度（1 U/µL）、RCA反应时间（2小时）和温度（42°C） 阅读提示：详见Materials and Methods中的RCA and RCA products' detection |
| 染色与封片 | DAB显色时间（8分钟）、苏木精复染、封片方法 阅读提示：详见Materials and Methods中的Staining and mounting |
| 临床样本检测 | 患者样本来源、伦理审批号（M2021005）、HER2评分系统细节（五级评分）、定量细胞数（至少50个） 阅读提示：详见Results中HER2 mRNA detection部分及Table 1，Materials and Methods中组织来源和伦理 |