临床样本和细胞系中circRNA 100146表达分析
评估circRNA 100146在CRC组织和细胞中的表达水平及其临床相关性。
利用GEO数据库（GSE126094）数据分析，并通过RT-qPCR检测58对CRC组织和邻近正常组织、四种CRC细胞系（SW620、SW480、HCT116、LOVO）和正常结肠上皮NCM460细胞中circRNA 100146的表达，并分析其与临床病理特征的相关性。
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环状RNA 100146通过微小RNA 149/HMGA2轴促进结直肠癌进展
Circular RNA 100146 Promotes Colorectal Cancer Progression by the MicroRNA 149/HMGA2 Axis.
实验完整度
高包含临床样本表达分析、体外细胞功能实验、双荧光素酶/RIP/RNA pulldown机制验证以及体内异种移植模型，证据层级完整。
主要模型
结直肠癌细胞系SW620和SW480 正常结肠上皮细胞系NCM460 结直肠癌患者组织样本（n=58） 裸鼠皮下异种移植和尾静脉转移模型
重点核对
circRNA 100146在CRC组织和细胞中表达上调 circRNA 100146敲低抑制增殖、迁移、侵袭，促进凋亡 miR-149负调控HMGA2，circRNA 100146通过海绵吸附miR-149上调HMGA2 HMGA2过表达逆转circRNA 100146敲低效应，miR-149结合位点突变丧失逆转能力 体内实验验证circRNA 100146敲低抑制肿瘤生长和肺转移
摘要
结直肠癌（CRC）已成为全球癌症相关死亡的第三大原因。研究证实，环状RNA（circRNAs）吸附微小RNA（miRNAs）以调节下游基因的功能。本研究旨在探讨circRNA 100146在CRC中的潜在机制。通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测circRNA 100146、miRNA 149（miR-149）和高迁移率族蛋白AT钩2（HMGA2）的表达。通过甲基噻唑基四唑（MTT）、流式细胞术和transwell实验评估一系列生物功能效应（细胞活力、凋亡、迁移/侵袭）。通过Western blot实验测量蛋白质水平。建立异种移植模型进行体内实验。通过双荧光素酶报告实验、RNA免疫沉淀实验或RNA pull-down实验评估circRNA 100146、miR-149和HMGA2之间的相互作用。circRNA 100146在CRC组织和细胞中上调。circRNA 100146敲低在体外抑制细胞增殖、促进凋亡、抑制迁移和侵袭，并在体内阻碍肿瘤生长。此外，miR-149受circRNA 100146负调控，并靶向HMGA2介导其表达。此外，miR-149干扰消除了circRNA 100146沉默在增殖、凋亡、迁移和侵袭中的活性。此外，HMGA2过表达减弱了上述由circRNA 100146沉默引起的效应，而HMGA2 3'非翻译区（3'-UTR）中miR-149结合位点的突变导致其失去这种能力。circRNA 100146敲低通过靶向miR-149/HMGA2轴抑制SW620和SW480细胞的增殖、增强凋亡并阻碍迁移和侵袭。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究circRNA 100146在结直肠癌进展中的作用及其潜在分子机制。
- 核心机制
- circRNA 100146作为分子海绵吸附miR-149，解除miR-149对HMGA2的抑制，从而上调HMGA2表达，促进CRC细胞增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡。
- 主要证据
- 体外细胞实验（MTT、流式、Transwell、Western blot）显示circRNA 100146敲低抑制CRC进展；双荧光素酶报告、RIP和RNA pulldown验证circRNA 100146-miR-149和miR-149-HMGA2相互作用；体内异种移植模型显示敲低circRNA 100146抑制肿瘤生长和转移。
- 研究意义
- circRNA 100146可能作为CRC早期诊断的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circRNA 100146敲低对CRC细胞功能的影响
验证circRNA 100146敲低对CRC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。
在SW620和SW480细胞中转染sh-circRNA 100146 no.1，通过MTT实验检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，Transwell实验检测迁移和侵袭，Western blot检测增殖、凋亡、迁移相关蛋白（PCNA、Bcl-2、E-cad、MMP9）表达。
circRNA 100146与miR-149相互作用验证
验证circRNA 100146是否直接结合并负调控miR-149。
通过核质分离实验确定circRNA 100146的亚细胞定位；通过starBase 3.0预测结合位点；双荧光素酶报告实验、RIP实验和RNA pulldown实验验证直接结合；RT-qPCR检测circRNA 100146敲低后miR-149表达变化及临床样本中miR-149表达。
miR-149抑制对circRNA 100146敲低效应的逆转
验证miR-149是circRNA 100146调控CRC细胞功能的关键下游分子。
在SW620和SW480细胞中共转染sh-circRNA 100146 no.1和anti-miR-149，通过MTT、流式、Transwell和Western blot检测细胞活力、凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白表达。
miR-149对HMGA2的靶向调控
验证miR-149是否直接靶向HMGA2并调控其表达。
通过starBase 3.0预测结合位点；双荧光素酶报告实验验证miR-149与HMGA2 3'-UTR结合；RT-qPCR和Western blot检测miR-149过表达或circRNA 100146敲低后HMGA2 mRNA和蛋白水平；放线菌素D处理检测HMGA2稳定性。
HMGA2过表达对circRNA 100146敲低效应的逆转
验证HMGA2是circRNA 100146/miR-149轴的关键效应分子，并确认miR-149结合位点的重要性。
在SW620和SW480细胞中共转染sh-circRNA 100146和Lv-HMGA2（野生型或3'-UTR突变型），通过RT-qPCR和Western blot检测HMGA2表达，MTT、流式、Transwell和Western blot检测细胞功能及相关蛋白。
体内验证circRNA 100146敲低对肿瘤生长和转移的影响
在体内模型中验证circRNA 100146敲低通过miR-149/HMGA2轴抑制CRC进展。
将稳定敲低circRNA 100146的SW620细胞皮下注射或尾静脉注射裸鼠，测量肿瘤体积和重量，计数肺转移结节；检测肿瘤组织中circRNA 100146、miR-149、HMGA2及相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能检测
分子相互作用验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA消化 | RNase R | Geneseed | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | All-in-One miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | GeneCopoeia | -- |
| TransScript第一链cDNA合成预混液 | TransGen Biotech | -- | |
| RT-qPCR | All-in-One miRNA RT-qPCR检测试剂盒 | GeneCopoeia | -- |
| MTT实验 | 甲基噻唑基四唑 | Sigma | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma | -- | |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Transwell实验 | Matrigel基质胶 | Becton, Dickinson | -- |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Cowbiotech | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| PCNA抗体 | Abcam | ab29 | |
| Bcl-2抗体 | Abcam | ab32124 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab1416 | |
| MMP9抗体 | Abcam | ab38898 | |
| HMGA2抗体 | Abcam | ab97276 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab37168 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 双荧光素酶报告实验 | pGL3载体 | Promega | -- |
| 荧光素酶报告检测试剂盒 | Promega | -- | |
| RIP实验 | Magna RNA免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| Ago2抗体 | Abcam | ab32381 | |
| IgG抗体 | Abcam | ab6721 | |
| RNA pulldown | C-1磁珠 | Life Technologies | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7 | GraphPad Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 样本量（58对）、组织类型（CRC和邻近正常）、分期和转移状态 阅读提示：Materials and Methods中的Tissues and cell culture部分 |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基（RPMI 1640 + 10% FBS）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods中的Tissues and cell culture部分 |
| 基因敲低和过表达 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）、转染序列（sh-circRNA 100146 no.1/no.2、miR-149 mimic、anti-miR-149、Lv-HMGA2）、转染效率验证 阅读提示：Materials and Methods中的Cell transfection部分 |
| 体外功能实验 | 细胞系（SW620/SW480）、转染组合、MTT检测时间点（24/48/72h）、凋亡检测时间（48h）、Transwell中Matrigel包被、显微镜随机视野计数 阅读提示：Materials and Methods中的MTT assay、Flow cytometry assay、Transwell assay部分 |
| 分子相互作用验证 | 双荧光素酶报告载体（WT/MUT）、RIP中Ago2和IgG抗体浓度、RNA pulldown中生物素标记探针和磁珠 阅读提示：Materials and Methods中的Dual-luciferase reporter assay、RNA immunoprecipitation (RIP) assay、Biotinylated RNA pulldown assay部分 |
| 体内实验 | 裸鼠品系、细胞注射数量和途径、肿瘤测量时间点（7/14/21/28天）、肺转移观察时间（8周） 阅读提示：Materials and Methods中的Murine xenograft assay部分 |