Identification of CCDC115 as an adverse prognostic biomarker in liver cancer based on bioinformatics and experimental analyses.
包含生物信息学分析（TCGA等数据库）和体外细胞实验（敲低/过表达、CCK-8、Transwell、Western blot），但缺乏体内实验和进一步机制验证。
HepG-2细胞系 HCCLM-3细胞系 Huh-7细胞系 MHCC97-H细胞系
CCDC115在TCGA-LIHC队列中的表达差异及生存分析（OS、PFS、DSS） CCDC115敲低/过表达对HepG-2和HCCLM-3细胞增殖、迁移的影响（CCK-8和Transwell） CCDC115表达对索拉非尼处理细胞存活的影响（浓度：HCCLM-3 1μM，HepG-2 0.2μM） PI3K-Akt通路蛋白（PI3K p110δ、PI3K p85α、Phospho-Akt、Akt）表达变化 风险模型的建立和验证（LASSO Cox回归，训练集和验证集）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CCDC115在肝癌组织和细胞系中的mRNA及蛋白表达水平。
利用TCGA、GTEx、GENT2、CPTAC等数据库分析CCDC115在多种肿瘤和正常组织中的表达；在TCGA-LIHC队列中比较肿瘤与正常组织的mRNA表达，并在50对配对样本中验证；通过Western blot检测4种肝癌细胞系（HepG-2、Huh-7、MHCC97-H、HCCLM-3）和正常肝细胞系L02中CCDC115蛋白表达。
探讨CCDC115表达与肝癌患者临床特征及预后的关系。
基于TCGA-LIHC队列，分析CCDC115表达与肿瘤分期、分级、种族、性别、年龄、淋巴结转移、TP53突变状态的关系；通过ROC曲线评估诊断价值；采用Kaplan-Meier分析及log-rank检验评估OS、PFS和DSS。
构建基于CCDC115相关基因的预后风险模型，并验证其预测能力。
利用STRING和Cytoscape构建PPI网络并筛选hub基因；使用WGCNA识别相关模块；通过LASSO Cox回归筛选7个基因（B3GAT3, CLN3, FAM234A, LAGE3, OXLD1, SF3B5, TALDO1）建立风险评分模型；在TCGA-LIHC训练集和GSE14520、ICGC-LIHC-JP验证集中进行生存分析和ROC曲线评估。
探索CCDC115在肝癌中的潜在功能和信号通路。
对TCGA-LIHC中CCDC115高表达组和低表达组的差异表达基因（DEGs）进行GO和KEGG富集分析，并用GSEA验证；重点关注PI3K-Akt通路，利用GEPIA2分析CCDC115与通路基因集的相关性。
评估CCDC115表达与免疫细胞浸润、免疫检查点分子和HLA基因的关系。
利用TIMER2.0分析CCDC115表达与多种免疫细胞浸润的相关性；基于TCGA-LIHC队列分析CCDC115与ICMs（PD-L1、CTLA-4等）和HLA基因的相关性。
验证CCDC115对肝癌细胞增殖、迁移和索拉非尼敏感性的影响。
使用慢病毒载体在HepG-2和HCCLM-3细胞中敲低或过表达CCDC115，通过CCK-8实验检测细胞活力（增殖），通过Transwell实验检测迁移能力；并检测不同浓度索拉非尼处理下的细胞存活率变化。
验证CCDC115是否调控PI3K-Akt通路关键蛋白的表达。
通过Western blot检测CCDC115敲低或过表达后PI3K p110δ、PI3K p85α、Phospho-Akt (Ser473)和Akt (pan)的蛋白表达变化。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Cytiva | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Sangon | -- | |
| RIPA 1640培养基 | Cytiva | -- | |
| 细胞转染 | 阴性对照慢病毒载体 | GenePharma | -- |
| CCDC115敲低慢病毒载体 | GenePharma | -- | |
| CCDC115过表达慢病毒载体 | GenePharma | -- | |
| 聚凝胺 | GenePharma | -- | |
| 嘌呤霉素 | GenePharma | -- | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | EnoGene | -- |
| 细胞迁移检测 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 结晶紫 | Biosharp | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Sangon Biotech | -- |
| cDNA合成 | Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | -- |
| qRT-PCR | FastStart Universal SYBR Green Master qPCR混合液 | Roche | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Sangon Biotech | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sangon Biotech | -- | |
| Western blot | ChemiSignal® Plus分析试剂盒 | CLINX | -- |
| ChemiScope成像系统 | CLINX | -- | |
| 抗CCDC115抗体 | Proteintech | 20636-1-AP | |
| 抗PI3K p110δ抗体 | Cell Signaling Technology | 34050s | |
| 抗PI3K p85α抗体 | Cell Signaling Technology | 13666s | |
| 抗Phospho-Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060s | |
| 抗Akt (pan)抗体 | Cell Signaling Technology | 2920s | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma | A5316 | |
| 抗GAPDH抗体 | Bioworld Technology | MB001 | |
| 山羊抗兔IgG | Zhuangzhi bio | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG | Zhuangzhi bio | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（HepG-2、Huh-7、MHCC97-H、HCCLM-3、L02），培养基（DMEM或RIPA 1640），血清浓度（10% FBS），抗生素（1%青霉素/链霉素），培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods, 2.6 Cell lines and treatment |
| 慢病毒感染与稳转株筛选 | 慢病毒载体（LV-NC-shRNA, LV-CCDC115-shRNA, LV-CCDC115-OE），感染MOI（HepG-2 80 pfu/cell，HCCLM-3 100 pfu/cell），polybrene浓度（5 μg/mL），感染时间（72h），嘌呤霉素筛选浓度（HepG-2 2 μg/mL，HCCLM-3 2.5 μg/mL） 阅读提示：Materials and methods, 2.6 Cell lines and treatment |
| 细胞活力检测（CCK-8） | 细胞接种密度（5×10^3 cells/well），CCK-8试剂孵育时间（40 min）和波长（450 nm） 阅读提示：Materials and methods, 2.7 Cell viability and migration assay |
| 细胞迁移检测（Transwell） | 细胞数量（1×10^5），上室无血清培养基，下室含20% FBS的DMEM，培养时间（24h），固定和染色条件（4%多聚甲醛15min，0.1%结晶紫20min） 阅读提示：Materials and methods, 2.7 Cell viability and migration assay |
| qRT-PCR | 引物序列（CCDC115, GAPDH），PCR循环参数（95°C 10min; 95°C 10s, 58°C 14s, 72°C 20s ×45），相对定量方法（2^-ΔΔCT） 阅读提示：Materials and methods, 2.8 qRT-PCR |
| Western blot | 一抗稀释比例（CCDC115 1:500，PI3K p110δ 1:1000，PI3K p85α 1:1000，Phospho-Akt 1:2000，Akt 1:2000，β-actin 1:5000，GAPDH 1:5000），二抗稀释比例（1:5000） 阅读提示：Materials and methods, 2.9 Immunoblotting |
| 药物处理（索拉非尼） | 索拉非尼浓度：敲低实验 HCCLM-3 1μM，HepG-2 0.2μM；过表达实验 HCCLM-3 5μM，HepG-2 1μM；处理时间（文中未明确说明） 阅读提示：Results, 3.5 CCDC115 was closely related to PI3K-Akt pathway and contributed to sorafenib resistance of liver cancer cells; Figure 12 |
