小鼠触须毛囊分离与培养
建立体外毛囊模型,评估DOP对毛囊生长的直接作用。
从C57BL/6J小鼠分离触须毛囊,用含100 μg/ml DOP或PBS的Williams E培养基培养6天,观察并测量触须生长长度。
Dendrobium officinale polysaccharide promotes angiogenesis as well as follicle regeneration and hair growth through activation of the WNT signaling pathway.
包含体外毛囊培养、细胞功能实验(CCK-8、EdU、管形成等)及Western blot验证,但缺乏体内动物模型验证。
小鼠触须毛囊 小鼠真皮乳头细胞(DPCs) 小鼠血管内皮细胞(MVECs)
DOP浓度100 μg/ml处理DPCs和MVECs 48小时 WNT通路抑制剂IWR-1浓度2.5 μM处理24小时 DPCs增殖和活性检测(CCK-8、EdU、ALP染色) MVECs血管生成能力检测(管形成、划痕、Transwell) WNT信号及靶蛋白表达(β-catenin、Cyclin D1、C-Myc)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立体外毛囊模型,评估DOP对毛囊生长的直接作用。
从C57BL/6J小鼠分离触须毛囊,用含100 μg/ml DOP或PBS的Williams E培养基培养6天,观察并测量触须生长长度。
评估DOP对真皮乳头细胞增殖和活性的影响。
小鼠DPCs用100 μg/ml DOP处理48小时,检测细胞活力(CCK-8)、增殖(EdU)、ALP活性、LDH水平及相关蛋白表达。
评估DOP对血管内皮细胞血管生成、迁移和侵袭的影响。
MVECs用100 μg/ml DOP处理48小时,进行管形成、划痕和Transwell实验,并检测血管生成相关蛋白表达。
验证DOP的作用是否通过WNT信号通路介导。
DPCs和MVECs经DOP处理后,再用WNT抑制剂IWR-1处理,观察DOP促进效果的逆转情况。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 毛囊培养 | Williams E培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1217601 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 链霉素 | GIBCO | -- | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| 高糖DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 药物处理 | 铁皮石斛多糖 | Solarbio | SD9310 |
| IWR-1 | Selleck Chemicals | S7086 | |
| 免疫荧光染色 | 山羊血清 | Zhongshan GoldenBridge | -- |
| 细胞角蛋白8抗体 | Proteintech | 17514-1-AP | |
| 多功能蛋白聚糖抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-27638 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 19245 | |
| CD31抗体 | Abcam | ab222783 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 上样缓冲液 | Beyotime | -- | |
| 脱脂牛奶 | Bio-Rad | -- | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| p-S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| VEGFA抗体 | Abcam | ab214424 | |
| Cyclin D1抗体 | Abcam | ab16663 | |
| MMP-3抗体 | Abcam | ab52915 | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 9562 | |
| MMP-2抗体 | Abcam | ab92536 | |
| MMP-9抗体 | Abcam | ab283575 | |
| C-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 5605 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. | -- | |
| ALP染色 | ALP染色液 | LEAGENE | DE0004 |
| 甲苯胺蓝染色 | 甲苯胺蓝染色液 | Solarbio | G3660 |
| LDH检测 | LDH活性检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K046-M |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning Incorporated | CLS356234 |
| 细胞培养 | 小鼠真皮乳头细胞 | Procell | CP-M312 |
| 小鼠血管内皮细胞 | BeNa | BNCC317467 | |
| 微板读取 | 酶标仪 | Bio-Rad | -- |
| 化学发光成像 | 化学发光成像系统 | Bio-rad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 毛囊培养 | 小鼠品系、周龄、性别;DOP浓度;培养时间;培养基成分 阅读提示:详见Methods 2.1 节 |
| 细胞培养与处理 | DPCs和MVECs的来源及培养条件;DOP浓度和处理时间;IWR-1浓度和处理时间 阅读提示:详见Methods 2.2 节 |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度;DOP浓度;处理时间;检测时间点 阅读提示:详见Methods 2.8 节 |
| 血管生成实验 | Matrigel浓度和体积;细胞接种密度;DOP处理时间 阅读提示:详见Methods 2.11 节 |
| Western blot | 抗体稀释比例;电泳条件;转膜条件;封闭条件 阅读提示:详见Methods 2.5 节 |