EnSC分离、培养与鉴定
获取并验证人子宫内膜干细胞(EnSCs)的特性
从人子宫内膜组织消化分离EnSCs,培养并鉴定其形态和表面标志物
Endometrial stem cell-derived exosomes repair cisplatin-induced premature ovarian failure via Hippo signaling pathway.
包含体外KGN细胞损伤模型、体内POF小鼠模型、功能验证(凋亡、增殖)和机制验证(Hippo通路蛋白和靶基因)等多个证据层级。
KGN人颗粒细胞系 顺铂诱导的颗粒细胞损伤模型 C57BL/6小鼠顺铂诱导的POF模型
KGN细胞用顺铂10 μM处理24小时建立损伤模型 EnSC-Exos处理浓度200 μg/mL,共培养72小时 Verteporfin浓度1 μM处理72小时 C57BL/6小鼠腹腔注射顺铂2 mg/kg,连续10天 EnSC-Exos尾静脉注射350 μg/只,隔日一次,共12天
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取并验证人子宫内膜干细胞(EnSCs)的特性
从人子宫内膜组织消化分离EnSCs,培养并鉴定其形态和表面标志物
获得并验证外泌体的特性
通过差速超速离心从EnSCs条件培养基中分离外泌体,并通过电镜、Western blot和BCA法进行表征
验证顺铂损伤GCs是否通过激活Hippo信号通路诱导凋亡
用不同浓度顺铂处理KGN细胞,检测凋亡率、凋亡相关蛋白、Hippo通路蛋白和靶基因表达
验证EnSC-Exos能否被损伤GCs摄取并发挥修复作用
用PKH26标记外泌体,与损伤GCs共培养,观察摄取;并通过EdU和流式细胞术评估增殖和凋亡
验证EnSC-Exos的作用机制涉及Hippo信号通路抑制
使用YAP抑制剂Verteporfin,比较EnSC-Exos单独或联合Verteporfin处理对损伤GCs的影响
验证EnSC-Exos在体内对POF小鼠卵巢功能的修复作用
C57BL/6小鼠腹腔注射顺铂建立POF模型,尾静脉注射EnSC-Exos,检测激素水平和卵巢组织学
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | SiJiqing | -- | |
| 外泌体分离 | 去除外泌体的胎牛血清 | VivaCell | C3801-0050 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Proandy | 10136-1 | |
| 外泌体标记 | PKH26红色荧光染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 维替泊芬 | MedChemExpress | HY-B0146 | |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | Beyotime | P0131 |
| 肌动蛋白绿色荧光探针 | Beyotime | C2201S | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 抗HSP70抗体 | Santa Cruz | sc-32239 | |
| 抗Alix抗体 | Santa Cruz | sc-53540 | |
| 抗CD81抗体 | Santa Cruz | sc-166029 | |
| 抗CD9抗体 | Cell Signaling Technologies | #13174 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technologies | #3700 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗MST1抗体 | Proteintech | 22245-1-AP | |
| 抗LATS1抗体 | Proteintech | 17049-1-AP | |
| 抗磷酸化MST1/MST2抗体 | Cell Signaling Technologies | #49332 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technologies | #14074 | |
| 抗磷酸化YAP抗体 | Cell Signaling Technologies | #13008 | |
| 抗磷酸化LATS1抗体 | Cell Signaling Technologies | #9157 | |
| 抗PCNA抗体 | Santa Cruz | sc-56 | |
| 抗Caspase-3抗体 | Santa Cruz | sc-7272 | |
| HRP标记的二抗 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| GAPDH抗体 | Bioworld Technology | AP0063 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT试剂盒(含gDNA Eraser) | Takara | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| 流式分析 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| EdU染色 | BeyoClick EdU-594试剂盒 | Beyotime | C0078S |
| ELISA | 小鼠ELISA试剂盒 | Meimian Biotechnology | -- |
| 免疫组化 | DAB底物试剂盒 | Beyotime | -- |
| 显微镜 | 透射电子显微镜 | Hitachi | H-7650 |
| 荧光显微镜 | Nikon | Ti-S | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS SP5 II | |
| 离心 | 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima L-80 XP |
| 图像采集 | 化学发光成像仪 | Tanon | 5200 |
| 图像分析 | 凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与损伤模型 | KGN细胞培养条件、顺铂浓度和处理时间 阅读提示:见Methods 2.2 Cell culture 和 2.4 Induction of GC apoptosis in vitro |
| 外泌体分离与处理 | 外泌体分离的离心参数、浓度和共培养时间 阅读提示:见Methods 2.3 Exosomes isolation, characterization and labeling |
| Hippo信号通路机制验证 | Verteporfin的浓度、处理时间及与EnSC-Exos的联合处理方式 阅读提示:见Methods 2.4 和 Figure 4 legend |
| 动物模型建立 | 小鼠品系、周龄、体重、顺铂剂量和给药方式 阅读提示:见Methods 2.10 Experimental animals, POF model establishment |
| 治疗与评估 | EnSC-Exos和Verteporfin的给药剂量、频率、途径及评估时间点 阅读提示:见Methods 2.10 和 Figure 5A |
| 激素检测 | 血清采集方法、ELISA试剂盒类型 阅读提示:见Methods 2.11 Enzyme linked immunosorbent assay |