子宫内膜干细胞来源的外泌体通过Hippo信号通路修复顺铂诱导的卵巢早衰

Endometrial stem cell-derived exosomes repair cisplatin-induced premature ovarian failure via Hippo signaling pathway.

作者信息Lijun Wang, Lihui Wang, Rongli Wang, Ting Xu, Jingyuan Wang, Zhiwei Cui, Feiyan Cheng, Wei Wang, Xinyuan Yang
PMID38831834
期刊Heliyon
发布时间2024-05-21
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e31639

实验完整度

包含体外KGN细胞损伤模型、体内POF小鼠模型、功能验证(凋亡、增殖)和机制验证(Hippo通路蛋白和靶基因)等多个证据层级。

主要模型

KGN人颗粒细胞系 顺铂诱导的颗粒细胞损伤模型 C57BL/6小鼠顺铂诱导的POF模型

重点核对

KGN细胞用顺铂10 μM处理24小时建立损伤模型 EnSC-Exos处理浓度200 μg/mL,共培养72小时 Verteporfin浓度1 μM处理72小时 C57BL/6小鼠腹腔注射顺铂2 mg/kg,连续10天 EnSC-Exos尾静脉注射350 μg/只,隔日一次,共12天

摘要

干细胞已被证明是治疗卵巢损伤(如卵巢早衰(POF))的新方法。然而,人子宫内膜干细胞(EnSCs)来源的外泌体(Exos)对卵巢功能衰退的影响仍需仔细阐明。本研究旨在探讨EnSC-Exos在体外顺铂诱导的颗粒细胞损伤模型或体内POF小鼠模型中恢复卵巢功能的机制,以及Hippo信号通路是否参与调控。在本研究中,我们成功建立了顺铂诱导的颗粒细胞损伤模型,并评估了Hippo信号通路在顺铂损伤的颗粒细胞(GCs)中的激活情况。此外,激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光证明EnSC-Exos可以转移到顺铂损伤的GCs中以减少细胞凋亡。另外,在顺铂损伤的GCs中加入EnSC-Exos后,YAP蛋白水平以及YAP/TEAD靶基因(如CTGF、ANKRD1)的表达增强,免疫荧光染色显示YAP进入细胞核增多,证实了Hippo信号通路的抑制。在体内,EnSC-Exos成功修复了小鼠模型中的POF。总的来说,我们的研究结果表明化疗诱导的POF与Hippo信号通路的激活有关。人EnSC-Exos通过调控Hippo信号通路显著提高了卵巢GCs的增殖和卵巢功能。这些发现为进一步理解EnSC-Exos在卵巢功能恢复中的作用提供了新的见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探讨人子宫内膜干细胞来源的外泌体(EnSC-Exos)是否通过Hippo信号通路修复顺铂诱导的卵巢早衰。
核心机制
EnSC-Exos通过抑制Hippo信号通路,促进YAP核转位和YAP/TAZ靶基因表达,从而促进颗粒细胞增殖和卵巢功能恢复。
主要证据
体外实验显示EnSC-Exos降低顺铂损伤GCs的凋亡率、增加增殖率,并上调YAP和靶基因表达;体内实验显示EnSC-Exos改善POF小鼠的卵巢功能,包括激素水平恢复和卵泡数量增加。
研究意义
为化疗诱导的卵巢早衰提供新的治疗策略,并阐明外泌体作用机制,为临床转化奠定理论基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

EnSC分离、培养与鉴定

获取并验证人子宫内膜干细胞(EnSCs)的特性

从人子宫内膜组织消化分离EnSCs,培养并鉴定其形态和表面标志物

2

EnSC-Exos的分离与表征

获得并验证外泌体的特性

通过差速超速离心从EnSCs条件培养基中分离外泌体,并通过电镜、Western blot和BCA法进行表征

3

体外顺铂诱导颗粒细胞损伤模型的建立与机制分析

验证顺铂损伤GCs是否通过激活Hippo信号通路诱导凋亡

用不同浓度顺铂处理KGN细胞,检测凋亡率、凋亡相关蛋白、Hippo通路蛋白和靶基因表达

4

EnSC-Exos对顺铂损伤GCs的摄取和功能验证

验证EnSC-Exos能否被损伤GCs摄取并发挥修复作用

用PKH26标记外泌体,与损伤GCs共培养,观察摄取;并通过EdU和流式细胞术评估增殖和凋亡

5

验证EnSC-Exos修复作用依赖于Hippo信号通路

验证EnSC-Exos的作用机制涉及Hippo信号通路抑制

使用YAP抑制剂Verteporfin,比较EnSC-Exos单独或联合Verteporfin处理对损伤GCs的影响

6

体内POF小鼠模型建立和EnSC-Exos治疗评估

验证EnSC-Exos在体内对POF小鼠卵巢功能的修复作用

C57BL/6小鼠腹腔注射顺铂建立POF模型,尾静脉注射EnSC-Exos,检测激素水平和卵巢组织学

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM/F12培养基HyClone--
胎牛血清SiJiqing--
去除外泌体的胎牛血清VivaCellC3801-0050
BCA蛋白定量试剂盒Proandy10136-1
PKH26红色荧光染料Sigma-Aldrich--
顺铂Sigma-Aldrich--
维替泊芬MedChemExpressHY-B0146
DAPI染料BeyotimeP0131
肌动蛋白绿色荧光探针BeyotimeC2201S
Triton X-100BeyotimeP0096
RIPA裂解液----
抗HSP70抗体Santa Cruzsc-32239
抗Alix抗体Santa Cruzsc-53540
抗CD81抗体Santa Cruzsc-166029
抗CD9抗体Cell Signaling Technologies#13174
β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technologies#3700
抗Bcl-2抗体Proteintech12789-1-AP
抗Bax抗体Proteintech50599-2-Ig
抗MST1抗体Proteintech22245-1-AP
抗LATS1抗体Proteintech17049-1-AP
抗磷酸化MST1/MST2抗体Cell Signaling Technologies#49332
抗YAP抗体Cell Signaling Technologies#14074
抗磷酸化YAP抗体Cell Signaling Technologies#13008
抗磷酸化LATS1抗体Cell Signaling Technologies#9157
抗PCNA抗体Santa Cruzsc-56
抗Caspase-3抗体Santa Cruzsc-7272
HRP标记的二抗ZSGB-BIOZB-2301
GAPDH抗体Bioworld TechnologyAP0063
TRIzol试剂Invitrogen--
PrimeScript RT试剂盒(含gDNA Eraser)Takara--
TB Green Premix Ex Taq IITakara--
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒BD Biosciences--
BeyoClick EdU-594试剂盒BeyotimeC0078S
小鼠ELISA试剂盒Meimian Biotechnology--
DAB底物试剂盒Beyotime--
透射电子显微镜HitachiH-7650
荧光显微镜NikonTi-S
共聚焦激光扫描显微镜LeicaTCS SP5 II
超速离心机Beckman CoulterOptima L-80 XP
化学发光成像仪Tanon5200
凝胶成像系统Bio-Rad--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与损伤模型
KGN细胞培养条件、顺铂浓度和处理时间
阅读提示:见Methods 2.2 Cell culture 和 2.4 Induction of GC apoptosis in vitro
外泌体分离与处理
外泌体分离的离心参数、浓度和共培养时间
阅读提示:见Methods 2.3 Exosomes isolation, characterization and labeling
Hippo信号通路机制验证
Verteporfin的浓度、处理时间及与EnSC-Exos的联合处理方式
阅读提示:见Methods 2.4 和 Figure 4 legend
动物模型建立
小鼠品系、周龄、体重、顺铂剂量和给药方式
阅读提示:见Methods 2.10 Experimental animals, POF model establishment
治疗与评估
EnSC-Exos和Verteporfin的给药剂量、频率、途径及评估时间点
阅读提示:见Methods 2.10 和 Figure 5A
激素检测
血清采集方法、ELISA试剂盒类型
阅读提示:见Methods 2.11 Enzyme linked immunosorbent assay