丙酸对巨噬细胞表型的影响
探究丙酸对巨噬细胞极化方向的调节作用。
用LPS诱导RAW264.7细胞促炎极化，用IL-4诱导抗炎极化，加入丙酸处理，检测表型标志物和细胞因子。
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产丙酸工程益生菌通过GPR43/HDAC1/IL-10轴恢复抗炎巨噬细胞改善小鼠溃疡性结肠炎
Propionate-producing engineered probiotics ameliorated murine ulcerative colitis by restoring anti-inflammatory macrophage via the GPR43/HDAC1/IL-10 axis.
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型（DSS诱导结肠炎）及机制验证（GPCR、HDAC通路），证据层级独立且完整。
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞（F4/80hiCD11bhi） RAW264.7巨噬细胞系 DSS诱导的C57BL/6J小鼠结肠炎模型
重点核对
EcNP3菌株的构建与丙酸产量（113.23±5.17 mg/L） DSS浓度3%及处理时间7天 EcNP3剂量5×10^7 CFU及给药方式口服 GPR43拮抗剂GLPG0974浓度2 μM HDAC1抑制剂CI994浓度5 μM
摘要
炎症性肠病（IBD）是一种胃肠道慢性非特异性炎症性疾病，目前的治疗方案往往无法维持长期缓解。研究表明，IBD患者粪便样本中丙酸水平降低。丙酸可通过肠上皮细胞和免疫调节改善IBD，但其对炎症微环境和巨噬细胞分化的影响尚未得到广泛研究。为了解决这一问题，我们构建了一种工程化产丙酸益生菌（EcNP3），以实现肠道丙酸水平的持续恢复并提高其生物利用度。采用DSS诱导的实验性肠炎模型评估EcNP3改善肠黏膜屏障和增加抗炎巨噬细胞比例的效果。结果发现，EcNP3对腹腔抗炎巨噬细胞（F4/80hiCD11bhi）的耗竭具有恢复作用，并显著提高IL-10的表达水平。同时，IL-1β、IL-6和CXCL1的表达下调，并在离体实验中抑制组织驻留巨噬细胞的凋亡。进一步研究表明，EcNP3通过G蛋白偶联受体43和组蛋白去乙酰化酶调节IL-10表达。此外，EcNP3显著抑制HDAC1蛋白表达并促进细胞组蛋白乙酰化水平。最后，EcNP3通过增加黏液产生和减少炎症浸润显著改善DSS诱导的小鼠结肠炎。我们的结果表明，工程化活体生物治疗产品EcNP3是一种安全且有效的IBD治疗方法，这为通过巨噬细胞IL-10信号治疗IBD定义了一种新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 丙酸及工程化产丙酸益生菌EcNP3是否通过调节巨噬细胞表型改善溃疡性结肠炎？
- 核心机制
- EcNP3通过GPR43受体抑制HDAC1表达，促进组蛋白乙酰化，上调抗炎巨噬细胞中IL-10的表达，从而改善结肠炎。
- 主要证据
- DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，EcNP3恢复F4/80hiCD11bhi巨噬细胞比例，升高IL-10，降低IL-1β、IL-6、CXCL1；体外实验证实EcNP3上调IL-10依赖GPR43和HDAC1抑制。
- 研究意义
- 工程化活体生物治疗产品EcNP3为IBD治疗提供了一种新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
产丙酸工程菌的构建与表征
构建并优化产丙酸工程菌EcNP3，验证其体外产酸能力及肠道定植能力。
以EcN为底盘，导入丙酸合成基因，敲除乙酸合成基因，测定丙酸产量，并在模拟结肠环境及小鼠肠道中评估产酸和定植。
EcNP3对DSS诱导结肠炎小鼠的治疗效果
评估EcNP3对DSS诱导结肠炎症状和肠道屏障的改善作用。
C57BL/6J小鼠随机分组，给予3%DSS建立结肠炎模型，同时给予EcNP3、EcN或丙酸钠干预，监测体重、疾病活动指数，结肠长度，组织病理和黏蛋白表达。
EcNP3对免疫细胞和细胞因子的调节
检测EcNP3对腹腔抗炎巨噬细胞比例和细胞因子表达的影响。
通过流式细胞术分析腹腔F4/80hiCD11bhi巨噬细胞比例，用Luminex和PCR检测血清和结肠组织细胞因子水平。
EcNP3对巨噬细胞功能的体外验证
验证EcNP3对巨噬细胞凋亡和细胞因子产生的直接影响。
用EcNP3发酵上清处理小鼠腹腔巨噬细胞，检测凋亡比例和细胞因子mRNA表达。
机制验证：GPR43和HDAC1通路
阐明EcNP3上调IL-10的分子机制。
使用GPR41拮抗剂3-HB和GPR43拮抗剂GLPG0974处理RAW264.7细胞，检测IL-10表达；使用HDAC抑制剂筛选并检测HDAC1表达和组蛋白乙酰化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 工程菌构建 | 大肠杆菌Nissle 1917 | Biobw | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 重组小鼠IL-4蛋白 | absin | abs04697 | |
| 流式分析 | TruStain FcX™封闭试剂 | Biolegend | -- |
| Zombie UV活/死染料 | Biolegend | -- | |
| APC/Cy7标记抗小鼠F4/80抗体 | Biolegend | -- | |
| PE-Texas Red标记抗小鼠CD11b抗体 | Biolegend | -- | |
| 免疫组化 | 抗MUC2抗体 | Abcam | ab272692 |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| 抗Occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP | |
| 抗Claudin2抗体 | Cusabio | CSB-PA070222 | |
| 抗Claudin5抗体 | Cusabio | CSB-PA001672 | |
| 细胞因子检测 | 10-Plex小鼠磁珠捕获细胞因子检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| FlexMap 3D仪器 | Luminex | -- | |
| RT-PCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| HiScript Q RT SuperMix反转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| ChamQ SYBR Color qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | 抗HDAC1抗体 | Abcam | ab109411 |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 抗组蛋白H3乙酰化K14抗体 | Abcam | ab52946 | |
| iNOS重组抗体 | Proteintech | 80517-1-RR | |
| Arginase-1单克隆抗体 | Proteintech | 66129-1-Ig | |
| CD163多克隆抗体 | Proteintech | 16646-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白重组抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| 山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| ELISA | 小鼠白细胞介素-10 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0046c |
| 小鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | |
| 试剂 | 3-羟基丁酸 | -- | -- |
| GLPG 0974 | -- | -- | |
| 曲古抑菌素A | -- | -- | |
| CI994 | -- | -- | |
| CAY-10683 | -- | -- | |
| RGFP996 | -- | -- | |
| PCI-34051 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株构建 | EcN来源（Biobw），质粒载体pETDuet和pCDFDuet-1，基因ldhA, pct, lcdA, acuI，组成型启动子J23119，敲除基因pflB和poxB，抗生素浓度（卡那霉素50μg/mL、壮观霉素50μg/mL、氨苄青霉素100μg/mL、链霉素50μg/mL） 阅读提示：详见Materials and Methods 2.1和2.2节 |
| DSS诱导结肠炎模型 | 小鼠品系C57BL/6J，性别雄性，年龄6-8周，DSS浓度3%，处理时间7天，EcNP3剂量5×10^7 CFU，丙酸钠200 mM，处理时间（第1-10天），对照组PBS 阅读提示：详见Materials and Methods 2.6节和Figure 3a |
| 巨噬细胞处理 | RAW264.7细胞，LPS浓度100 ng/mL，丙酸浓度20 mM，IL-4浓度20 ng/mL，处理时间24小时 阅读提示：详见Materials and Methods 2.13节和Results 3.1节 |
| 机制验证 | GPR43拮抗剂GLPG0974浓度2 μM，GPR41拮抗剂3-HB浓度5 mM，HDAC抑制剂浓度（Trichostatin A 20 nM，CI994 5 μM，CAY-10683 100 nM，RGFP996 5 μM，PCI-34051 10 μM），处理时间24小时 阅读提示：详见Results 3.7和3.8节 |