鉴定PKM2为PGAM1的相互作用蛋白
筛选并验证能与PGAM1直接相互作用的PEP利用酶。
通过免疫共沉淀、pulldown和生物层干涉法检测PGAM1与PKM2、ENO1、PKM1、PCK2的相互作用。
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PKM2作为组氨酸激酶磷酸化PGAM1并增加癌症中的糖酵解分流
PKM2 functions as a histidine kinase to phosphorylate PGAM1 and increase glycolysis shunts in cancer.
实验完整度
高包含体外激酶实验、细胞功能验证、代谢通量分析、动物移植瘤模型及患者样本分析等多个独立证据层级，并明确功能与机制验证。
主要模型
A549细胞 MCF-7细胞 BALB/c裸鼠移植瘤模型 肺癌患者组织样本
重点核对
PKM2 K270M突变消除PGAM1 H11磷酸化，验证PEP依赖性 TEPP46稳定PKM2四聚体阻断PGAM1结合及H11磷酸化 PGAM1 Y119F突变破坏PKM2结合及H11磷酸化，影响糖酵解分流和肿瘤生长 pY119-TAT肽（25 μM）处理减少PGAM1–PKM2相互作用 10 mg/kg pY119-TAT肽腹腔注射隔日一次，共10天，抑制肿瘤生长
摘要
磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）是一个关键的节点酶，它将糖酵解的代谢反应转向其分流途径，以支持大分子生物合成，从而促进快速和可持续的细胞增殖。PGAM1活性在多种肿瘤中普遍上调；然而，其潜在机制仍不清楚。在此，我们揭示丙酮酸激酶M2（PKM2）以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）依赖的方式兼任组氨酸激酶，催化PGAM1 H11磷酸化，这对PGAM1活性至关重要。此外，单体和二聚体PKM2（而非四聚体PKM2）能有效磷酸化并激活PGAM1。响应表皮生长因子信号，Src催化的PGAM1 Y119磷酸化是PKM2结合和随后的PGAM1 H11磷酸化的先决条件，这构成了肿瘤细胞与正常细胞之间的差异。一种源自PGAM1的含pY119的细胞通透性肽或Y119突变破坏了PGAM1与PKM2的相互作用以及PGAM1 H11磷酸化，削弱了糖酵解分流和肿瘤生长。总之，这些结果确定了PKM2作为组氨酸激酶的功能，并阐明了酶串扰作为代谢重编程和肿瘤发生过程中的一种调节模式的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PGAM1活性在肿瘤中上调的机制是什么，以及PKM2是否作为组氨酸激酶磷酸化PGAM1并影响糖酵解分流？
- 核心机制
- PKM2以PEP为磷酸供体，作为组氨酸激酶直接磷酸化PGAM1 H11，而EGF-Src信号介导的PGAM1 Y119磷酸化是PKM2识别和结合PGAM1的先决条件，从而增强PGAM1活性并促进糖酵解分流。
- 主要证据
- 体外激酶实验证实PKM2直接磷酸化PGAM1 H11；PKM2敲低或K270M突变减少H11磷酸化；Y119F突变阻断PKM2结合及H11磷酸化，并抑制PPP和SSP、降低DNA合成和脂质生成；动物实验中Y119F突变或pY119-TAT肽抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究鉴定PKM2为组氨酸激酶，阐明酶串扰作为代谢重编程调节模式的重要性，并提示靶向PKM2–PGAM1调节代谢节点可能为癌症治疗提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PKM2对PGAM1 H11的磷酸化
确定PKM2是否以PEP为磷酸供体直接磷酸化PGAM1的H11位点。
使用体外激酶实验，结合3-pHis抗体检测PGAM1 H11磷酸化，并测试ATP、PEP、GTP等磷酸供体及PKM1、ENO1、NME1/2的替代。
确定PKM2寡聚状态对磷酸化的影响
探究PKM2单体、二聚体和四聚体形式对PGAM1 H11磷酸化的影响。
使用PKM2激活剂TEPP46稳定四聚体，并通过PKM2突变体（K422R、R399E、Y105E）模拟不同寡聚状态，检测PGAM1结合和H11磷酸化。
鉴定PGAM1 Y119磷酸化及其上游信号
确定PGAM1酪氨酸磷酸化位点及其上游激酶，明确其在PKM2识别中的作用。
通过质谱鉴定PGAM1磷酸化位点，利用定点突变和PTP1B处理验证Y119的重要性；使用激酶抑制剂和体外激酶实验确定Src为Y119磷酸化激酶。
评估PGAM1 Y119突变对糖酵解分流和细胞增殖的影响
验证PGAM1 Y119磷酸化对糖酵解分流、大分子合成和细胞增殖的功能影响。
在PGAM1敲低并回补WT或Y119F的A549细胞中检测PGAM1活性、代谢通量（[13C6]-葡萄糖追踪）、DNA合成（EdU）、脂质水平、NADPH/ROS以及细胞增殖和集落形成，并评估体内肿瘤生长。
验证pY119-TAT肽的体内治疗效果
评估含pY119的细胞通透性肽是否能阻断PGAM1–PKM2相互作用并抑制肿瘤生长。
合成pY119-TAT肽，进行体外细胞实验检测其对PGAM1–PKM2相互作用和H11磷酸化的影响；在A549异种移植瘤模型中腹腔注射肽段，评估肿瘤体积和质量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证代谢变化
验证体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ham's F-12K培养基 | Sigma | -- |
| DMEM培养基 | Sigma | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | -- | |
| T细胞分离 | AutoMACS系统 | Miltenyi | -- |
| T细胞活化 | 重组人IL-2 | Invitrogen | -- |
| Dynabeads人T活化剂CD3/CD28 | Invitrogen | -- | |
| FACSCantoII流式细胞仪 | BD | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 生长因子处理 | 表皮生长因子 | R&D Systems | -- |
| 成纤维细胞生长因子1 | Abclonal | -- | |
| 血小板衍生生长因子A | Abclonal | -- | |
| 体外激酶实验 | 2,3-二磷酸甘油酸 | Sigma | -- |
| 三磷酸腺苷 | Sigma | -- | |
| 三磷酸鸟苷 | Sigma | -- | |
| 激酶抑制剂处理 | 阿法替尼 | Selleck | -- |
| 鲁索替尼 | Selleck | -- | |
| 阿木伐替尼 | Selleck | -- | |
| 萨拉卡替尼 | Selleck | -- | |
| Zoligratinib (CH5183284) | Selleck | -- | |
| 克雷诺拉尼 | Selleck | -- | |
| PKM2四聚体稳定 | TEPP46 | MedChemExpress | -- |
| 重组蛋白 | His标记NME1蛋白 | Solarbio | -- |
| NME2蛋白 | Abcam | -- | |
| DARTS实验 | 链霉蛋白酶 | Sigma | -- |
| 细胞裂解 | WB-IP裂解液 | Beyotime | -- |
| 免疫沉淀 | Protein A/G PLUS琼脂糖珠 | Santa Cruz | -- |
| Western blot | 抗PGAM1抗体 | Santa Cruz | 130334 |
| 抗PKM2抗体 | CST | 4053S | |
| 抗PKM1抗体 | CST | 7067 | |
| 抗NME1抗体 | Abclonal | A8802 | |
| 抗NME2抗体 | Abclonal | A7443 | |
| 抗磷酸化酪氨酸(pTyr)抗体 | CST | 8954 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Sigma | A4700 | |
| 抗ENO1抗体 | CST | 3810 | |
| 抗PCK2抗体 | SAB | A11526 | |
| 抗His抗体 | TransGen | 32301 | |
| 抗GST抗体 | TransGen | ab2739 | |
| 抗HA抗体 | TransGen | HT301-01 | |
| 抗3-磷酸组氨酸抗体 | Millipore | MABS1351 | |
| 抗微管蛋白抗体 | TransGen | HC101-01 | |
| 抗EGFR抗体 | Abclonal | A23452 | |
| 抗pEGFR抗体 | SAB | 11220 | |
| 抗STAT3抗体 | CST | 9139S | |
| 抗pSTAT3抗体 | CST | 9145S | |
| 抗c-Kit抗体 | Abclonal | A0357 | |
| 抗pc-Kit抗体 | Abclonal | AP0586 | |
| 抗Src抗体 | Abclonal | A11707 | |
| 抗pSrc抗体 | Abclonal | AP1377 | |
| 抗FGFR1抗体 | Abclonal | A21219 | |
| 抗pFGFR1抗体 | Abclonal | AP1317 | |
| 抗PDGFRA抗体 | Abclonal | A2103 | |
| 抗pPDGFRA抗体 | Abclonal | AP0615 | |
| 免疫组化 | 抗Ki-67抗体 | CST | 34330 |
| PGAM1 pY119抗体 | Abclonal Technology | -- | |
| Western blot | 山羊抗小鼠IgG二抗（HRP标记） | SAB | L3032 |
| 山羊抗兔IgG二抗（HRP标记） | SAB | L3012 | |
| 免疫沉淀 | 小鼠IgG | Sigma | I8765 |
| 兔IgG | Sigma | I8140 | |
| 重组蛋白表达 | 异丙基硫代半乳糖苷 | Sigma | -- |
| BLI | Ni-NTA生物传感器 | Pall ForteBio | -- |
| ITC | MicroCal PEAQ-ITC量热仪 | Malvern Paralytical | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| PGAM1活性测定 | 磷酸甘油酸变位酶活性检测试剂盒 | BioVision | K2007 |
| 代谢物分析 | 超高效液相色谱-高分辨质谱 | Agilent, Sciex | -- |
| ACQUITY HSS-T3色谱柱 | Waters | -- | |
| ACQUITY BEH Amide色谱柱 | Waters | -- | |
| EdU检测 | EdU | -- | -- |
| Click-iT细胞反应缓冲液试剂盒 | Invitrogen | C10269 | |
| Alexa Fluor 647叠氮化物 | Invitrogen | A10277 | |
| 细胞核染色 | DAPI | Sigma | D9542 |
| 显微镜成像 | 蔡司LSM880共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 脂质分析 | ThermoFisher Ultimate 3000超高效液相色谱系统 | ThermoFisher | -- |
| CSH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| Q Exactive四极杆-轨道阱质谱 | ThermoFisher | -- | |
| NADPH测定 | NADP/NADPH定量试剂盒 | Biovision | K347 |
| ROS检测 | CellROX深红流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | C10422 |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| pY119-TAT肽 | pY119-TAT肽 | Scilight Biotechnology | -- |
| 统计分析 | Prism 8软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外激酶实验 | 反应缓冲液pH（8.8）、磷酸供体（PEP 0.5 mM）、反应温度（30°C）和时间（30分钟）、蛋白浓度（PGAM1 10 μg/mL, PKM2 20 μg/mL） 阅读提示：Methods: In vitro kinase assay |
| PKM2寡聚状态实验 | TEPP46浓度（50 μM）和处理时间（24小时）、PKM2突变体（K422R、R399E、Y105E）的转染时间（48小时） 阅读提示：Results: De-tetramerization is favorable... 和 Figure 2 图注 |
| EGF信号实验 | EGF浓度（100 ng/mL）和处理时间（30分钟）、血清饥饿时间（48小时）、抑制剂浓度（Afatinib等1 μM）及预处理时间（3小时） 阅读提示：Results: EGF signaling accounts for PGAM1 Y119 phosphorylation 和 Figure 4 图注 |
| 代谢通量分析 | [13C6]-葡萄糖浓度（25 mM）和处理时间（24小时）、细胞数量（常规培养）、色谱柱（HSS-T3和BEH Amide） 阅读提示：Figure 5B 图注 和 Methods: [13C6]-glucose tracing assessment |
| 动物实验 | 细胞数量（1×10^6）、Matrigel体积（50 μL）和PBS体积（100 μL）、小鼠品系（BALB/c-nude, 雌性, 6-8周龄）、pY119-TAT肽剂量（10 mg/kg）和给药频率（隔日一次）、肿瘤取材时间（15或14天） 阅读提示：Methods: Tumor xenograft analysis 和 Figure 5E-G、Figure 7C-G 图注 |