体外受精（IVF）
获取绵羊受精卵用于电穿孔基因编辑。
从屠宰场收集绵羊卵巢，体外成熟卵母细胞，采用上游法选择精子，进行IVF，培养受精卵。
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电穿孔递送Cas9 sgRNA核糖核蛋白介导的绵羊IVF受精卵基因组编辑
Electroporation Delivery of Cas9 sgRNA Ribonucleoprotein-Mediated Genome Editing in Sheep IVF Zygotes.
实验完整度
高包含体外受精、电穿孔参数优化、基因编辑效率对比、ssODN敲入以及胚胎移植产生基因编辑羔羊等多个独立实验层级，并进行了功能验证和机制验证（如RNP质量影响）。
主要模型
绵羊IVF受精卵 绵羊囊胚 MSTN基因编辑羔羊
重点核对
电穿孔参数：Settings 1和3（电压40 V/42 V，脉冲长度3.5 ms/3.0 ms） 电穿孔时间：受精后6小时 Cas9 RNP类型：预孵育的sf-Cas9 RNPs+sgRNA或完全体外组装的Cas9 RNPs ssODN浓度：420 ng/μL，长度99 nt 胚胎移植：5枚囊胚移植入1只受体母羊
摘要
利用电穿孔递送CRISPR/Cas9系统组分，已在哺乳动物受精卵中实现高效基因编辑，促进了基因组编辑动物的开发。在本研究中，我们以绵羊ACTG1和MSTN基因为靶点，揭示了电穿孔中的阈值现象，即绵羊体外受精（IVF）受精卵存在电压耐受性。研究了接近40 V的不同穿孔电压和脉冲持续时间对绵羊受精卵电穿孔的影响。研究得出结论，较强的电场需要较短的脉冲持续时间，以达到高基因突变率和合理囊胚发育的最佳条件。本研究还评估了Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物（Cas9 RNPs）的质量及其对绵羊早期胚胎基因组编辑效率的影响。研究强调，在电穿孔前将Cas9蛋白与单向导RNA（sgRNA）预先复合对于实现高突变率至关重要。使用适合绵羊IVF受精卵的电穿孔参数，可获得显著高的突变率和杂合子比例。通过电穿孔将Cas9 RNPs和单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）递送至受精卵，靶向MSTN（肌生成抑制素）基因，达到了26%的敲入效率。通过电穿孔将Cas9 RNPs递送至IVF受精卵，成功生成了MSTN修饰羔羊。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过电穿孔将Cas9 RNP高效递送至绵羊IVF受精卵，实现基因敲除和敲入？
- 核心机制
- 电穿孔参数（电压和脉冲长度）存在阈值现象，需匹配；Cas9蛋白与sgRNA预复合是高效编辑的关键。
- 主要证据
- 通过优化电穿孔参数，ACTG1基因突变率从30.28%提高到87.78%或82.14%；MSTN基因突变率约84%；ssODN敲入效率达26%；胚胎移植后获得两只MSTN基因编辑羔羊，突变率94%以上。
- 研究意义
- 证明了电穿孔递送Cas9 RNP可用于绵羊基因组编辑，为绵羊育种和基因改良提供了有效工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
电穿孔参数优化
确定适合绵羊IVF受精卵的最佳电穿孔参数。
使用ACTG1基因的sf-Cas9 RNPs，比较了三种不同电穿孔设置（电压和脉冲长度）对卵裂率和囊胚率的影响。
比较不同Cas9 RNP配方的基因编辑效率
评估Cas9 RNP质量对基因编辑效率的影响。
比较了三种Cas9 RNP配方（sf-Cas9 RNPs、sf-Cas9 RNPs+sgRNA、完全体外组装的Cas9 RNPs）在ACTG1位点的突变率。
MSTN基因敲除
验证电穿孔在另一个基因位点的编辑效率。
使用完全体外组装的Cas9 RNPs靶向MSTN基因，采用设置1和3进行电穿孔，评估突变率。
ssODN介导的敲入
评估Cas9 RNP和ssODN通过电穿孔在MSTN位点实现精准敲入的效率。
将Cas9 RNPs和针对MSTN的ssODNs共同电穿孔进入受精卵，通过TIDER和Sanger测序分析敲入效率。
胚胎移植及后代鉴定
验证电穿孔基因编辑胚胎能否发育为基因编辑个体。
将5枚经电穿孔处理的MSTN基因编辑囊胚移植入一只受体母羊，分娩后对羔羊进行基因型鉴定。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 电穿孔 | NEPA21超级电穿孔仪 | Nepagene | -- |
| Nepa电穿孔比色皿（1mm间隙） | Nepagene | EC-001 | |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| 体外成熟 | TCM-199培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10100147C | |
| 促卵泡激素 | ICP | -- | |
| 体外培养 | MEM非必需氨基酸溶液(100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 |
| MEM氨基酸溶液EAA(50X) | Thermo Fisher Scientific | 11130051 | |
| 卵母细胞回收 | HEPES缓冲的TCM-199 | Procell | PM150612 |
| DNA提取 | DNA提取缓冲液 | Epicentre | QE09050 |
| PCR | Taq PCR预混液(2X，含蓝染料) | Sangon Biotech | B639295 |
| Cas9 RNP制备 | 重组Cas9蛋白 | Thermo Fisher Scientific | A36498 |
| sgRNA合成 | sgRNA | Genebiogist | -- |
| ssODN合成 | ssODN | Sangon Biotech | -- |
| 限制性酶切 | EcoR I限制性内切酶 | TAKARA | 1611 |
| EcoR V限制性内切酶 | TAKARA | 1612 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外受精（IVF） | 卵母细胞来源、成熟培养时间（24小时）、精子浓度（5×10^6/mL）、受精时间（6小时） 阅读提示：Materials and Methods 4.3, 4.4 |
| 电穿孔 | 电穿孔参数（设置1：40V,3.5ms；设置3：42V,3.0ms），电穿孔时间（受精后6小时），细胞数量（每个电穿孔20μL体系） 阅读提示：Materials and Methods 4.9, 4.10 |
| Cas9 RNP制备 | RNP类型、浓度（sf-Cas9 RNPs 120 ng/μL；Cas9 RNPs 250 ng/μL）、预孵育条件（摩尔比1:2，室温10分钟） 阅读提示：Materials and Methods 4.7 |
| 基因编辑检测 | PCR引物、测序方法（Sanger）、分析软件（TIDE/TIDER） 阅读提示：Materials and Methods 4.11 |
| 胚胎移植 | 移植囊胚数量（5枚）、受体母羊处理（CIDR同步发情）、移植时间（IVF后第6天） 阅读提示：Materials and Methods 4.12 |