建立小鼠TP/LPS肝损伤模型
验证TP/LPS能够诱导肝损伤及其时间依赖性。
雌性C57BL/6J小鼠给予TP（500 μg/kg）灌胃，2小时后注射LPS（0.1 mg/kg），在LPS后3、4、6小时收集样本。
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蛋白酶体活性抑制介导雷公藤甲素/脂多糖诱导肝毒性中的内质网应激-凋亡
Proteasome activity inhibition mediates endoplasmic reticulum stress-apoptosis in triptolide/lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity.
实验完整度
高包含体内小鼠模型和体外AML12细胞实验，涵盖ROS、ERS、蛋白酶体活性、凋亡蛋白检测及siRNA敲低验证，证据层级多元。
主要模型
雌性C57BL/6J小鼠TP/LPS肝损伤模型 AML12小鼠肝细胞系 TP/TNF-α处理AML12细胞模型
重点核对
TP 500 μg/kg 灌胃，LPS 0.1 mg/kg 腹腔注射，给药间隔2小时 NAC 300 mg/kg 腹腔注射，在TP/LPS后1小时给予 4-PBA 400 mg/kg 腹腔注射，在TP/LPS前1小时给予 MG-132 处理AML12细胞浓度5-20 μM，处理24小时 siRNA-ATF4转染AML12细胞，转染8小时后更换培养基，再24小时后给予TP/TNF-α
摘要
雷公藤甲素（TP）是中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. F.）的主要活性及毒性成分，具有多种治疗性生物活性。在毒性效应中，TP的肝毒性值得高度重视。此前，我们研究组提出了关于TP相关肝毒性的新观点：在脂多糖（LPS）刺激下的肝脏超敏反应。然而，TP/LPS诱导的肝脏超敏反应机制仍不清楚。在本研究中，我们从蛋白酶体活性抑制、活化内质网应激（ERS）相关凋亡以及活性氧（ROS）积累的角度，研究了TP/LPS诱导超敏反应的机制。结果显示，N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为一种常见的ROS抑制剂，降低了与FLIP增强相关的cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达。此外，4-苯基丁酸（4-PBA）作为一种ERS抑制剂，能够通过降低ERS相关凋亡蛋白表达（GRP78、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、cleaved caspase-3和cleaved PARP）和ROS水平来减轻TP/LPS诱导的肝毒性，其中ATF4是不可或缺的介质。此外，蛋白酶体活性抑制剂MG-132进一步加重了ERS相关凋亡，这表明蛋白酶体活性抑制在TP/LPS相关肝损伤中也发挥重要作用。总之，我们提出TP/LPS可能通过抑制蛋白酶体活性并通过ATF4增强ROS产生，从而上调ERS相关凋亡的激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TP/LPS诱导的肝毒性是否通过抑制蛋白酶体活性激活ERS相关凋亡和ROS积累，以及ATF4在此过程中的作用。
- 核心机制
- TP/LPS通过抑制蛋白酶体活性，激活ERS的GRP78-ATF4-CHOP通路，并增强ROS产生，从而诱导肝细胞凋亡。
- 主要证据
- 体内模型显示TP/LPS增加ERS和凋亡标志物，4-PBA和NAC减轻损伤；体外实验表明siATF4敲低降低凋亡和ROS，MG-132加重凋亡。
- 研究意义
- 揭示了TP/LPS肝毒性的新机制，表明维持蛋白酶体活性可能成为治疗策略，ATF4是肝细胞存活或死亡的关键调节因子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ROS在肝损伤中的作用
评估ROS积累是否介导TP/LPS诱导的肝损伤。
给予NAC（300 mg/kg）腹腔注射，检测ROS、GSH、ALT、AST水平及凋亡蛋白表达。
验证ERS抑制剂4-PBA的保护作用
评估抑制内质网应激是否能减轻TP/LPS诱导的肝损伤和氧化应激。
小鼠预先给予4-PBA（400 mg/kg），然后进行TP/LPS处理，检测肝组织学、ALT/AST、ROS、GSH及ERS相关蛋白。
体外验证4-PBA保护作用
在AML12细胞中验证4-PBA抑制ERS相关凋亡的效应。
使用TP/TNF-α处理AML12细胞，给予4-PBA（2.5 mM），检测LDH释放、ERS蛋白和凋亡蛋白。
ATF4敲低验证其功能
确定ATF4是否是TP/LPS诱导凋亡和ROS积累的关键介质。
使用siRNA-ATF4转染AML12细胞，随后TP/TNF-α处理，检测LDH、ROS、凋亡蛋白和CHOP表达。
检测蛋白酶体活性及其抑制影响
探讨TP/LPS是否通过抑制蛋白酶体活性诱导ERS。
在体内和体外检测蛋白酶体活性，并用蛋白酶体抑制剂MG-132处理AML12细胞，观察ERS和凋亡蛋白变化。
评估MG-132与TP/TNF-α的联合效应
验证抑制蛋白酶体活性是否加重TP/TNF-α诱导的细胞毒性。
AML12细胞联合MG-132和TP/TNF-α处理，检测蛋白酶体活性、LDH、CCK8以及凋亡蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 雷公藤甲素 | Sanling Biotechnology Company | 38748-32-2 |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2755 | |
| 4-苯基丁酸 | Sigma-Aldrich | P21005 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| 丁羟茴醚 | Sigma-Aldrich | B1253 | |
| MG-132 | MedChemExpress | 133407-82-6 | |
| 蛋白酶体活性检测 | Suc-LLVY-AMC | MedChemExpress | 94367-21-2 |
| 血清生化检测 | ALT检测试剂盒 | Nanjing Wittmann Biotechnology | -- |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Wittmann Biotechnology | -- | |
| 氧化应激检测 | GSH检测试剂盒 | Nanjing Beyotime | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Nanjing Beyotime | -- |
| 蛋白质提取 | 蛋白裂解液 | Nanjing Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Vazyme Biotech | -- |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Vazyme Biotech | -- |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme Biotech | -- | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | Gibco | -- |
| ROS检测 | CellROX Green试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 细胞毒性检测 | CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| siRNA敲低 | siRNA-ATF4-688 | Shanghai Gemma Pharmaceuticals | -- |
| siRNA-ATF4-1132 | Shanghai Gemma Pharmaceuticals | -- | |
| Western blot | cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 |
| FLIP抗体 | Cell Signaling Technology | 56343s | |
| ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815s | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9722.0 | |
| p-eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 9721s | |
| CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| GRP78抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1050 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365062 | |
| cleaved PARP抗体 | Abcam | ab32064 | |
| β-actin抗体 | Affinity Biosciences | T0022 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG | JAX | -- |
| Western blot | 山羊抗兔HRP二抗 | Thermo Fisher Scientific | 31460 |
| 山羊抗小鼠HRP二抗 | Thermo Fisher Scientific | 31430 | |
| 细胞培养 | CM-0602完全培养基 | Procell Life Science & Technology | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测 | -- | -- |
| 细胞核染色 | DAPI | Beyotime Biotechnology | -- |
| 组织学检测 | TUNEL试剂盒 | Servicebio | -- |
| 荧光检测 | VARIOSKAN LUX多功能酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 荧光成像 | FV-3000激光共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| PCR | Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | StepOne实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：雌性C57BL/6J；年龄6-8周；体重18-20g；TP给药剂量500 μg/kg灌胃；LPS剂量0.1 mg/kg腹腔注射；NAC剂量300 mg/kg腹腔注射；4-PBA剂量400 mg/kg腹腔注射；给药顺序和时间点；对照组溶剂（0.5% CMC-Na或PBS）剂量10 mL/kg。 阅读提示：Methods中的"Animals and experimental model" |
| 体外细胞模型 | 细胞系：AML12；培养基：CM-0602；TP浓度50 nM；TNF-α浓度50 ng/mL；处理时间24小时；siRNA浓度20 μM；转染时间8小时；4-PBA浓度2.5 mM；BHA浓度100 μM；MG-132浓度范围1-50 μM（常用10 μM）。 阅读提示：Methods中的"Cell culture and cell viability assays"、"Cell transfection of siRNAs"及"Results"中的相关图注 |
| 生化检测 | 血清ALT和AST检测：离心条件1000×g 15分钟，340 nm测定；GSH检测：血浆离心600×g 10分钟，加入蛋白去除剂M，再10000×g离心10分钟，412 nm测定。 阅读提示：Methods中的"Serum biochemistry analysis"和"Measurement of GSH" |
| ROS检测 | ROS染料：DCFH-DA或CellROX Green；组织量10 mg；荧光检测波长：激发488 nm，发射525 nm；检测时间点：体内4小时和6小时，体外3小时和24小时。 阅读提示：Methods中的"ROS assay" |
| 蛋白酶体活性 | 底物：Suc-LLVY-AMC（CAS 94367-21-2）；组织量20 mg；荧光信号检测间隔15分钟，至少2小时；激发380 nm，发射460 nm；检测时间点：体内6小时，体外1.5、2和24小时。 阅读提示：Methods中的"Proteasome activity assay" |
| 组织学与凋亡检测 | 肝脏切片厚度3-5 μm；H&E染色；TUNEL试剂盒使用步骤；荧光显微镜观察。 阅读提示：Methods中的"Histopathological examination"和"TUNEL assay" |
| 蛋白表达分析 | BCA定量；SDS-PAGE；PVDF膜；封闭液5% BSA；一抗孵育条件：4℃过夜；二抗室温1小时；ECL显影。 阅读提示：Methods中的"Western blot analysis" |