重组PEDV-S1蛋白表达与纯化
获得具有天然构象和高免疫原性的S1蛋白，用于免疫小鼠。
将编码PEDV S1亚基（234-736氨基酸）的基因克隆至pcDNA3.4载体，转染HEK293F细胞表达，采用Ni2+柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白的高亲和力单克隆抗体
High-affinity monoclonal antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus S1 protein.
实验完整度
高包含重组蛋白表达纯化、小鼠免疫、杂交瘤筛选、抗体亚型鉴定、表位分析、IFA和FCA检测，以及重组抗体表达纯化等多层级实验验证。
主要模型
BALB/c小鼠 HEK293F细胞 Vero E6细胞 PEDV-SP-C株
重点核对
小鼠免疫剂量：200 μg/只，皮下注射加完全佐剂，腹腔注射加不完全佐剂，间隔2周 杂交瘤融合比例：脾细胞与SP2/0细胞5:1 抗体EC50测定：间接ELISA，浓度范围84.77-0.89 pM IFA和FCA检测条件：Vero E6细胞感染PEDV，MOI=0.1，感染后48小时收集细胞 表位分析：将S1蛋白分为S1-1至S1-5五个片段，各片段间有25个氨基酸重叠
摘要
猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染给全球养猪业造成巨大的经济损失。该病原体可感染所有猪，对哺乳仔猪尤其具有高致死风险。刺突蛋白的S1亚基是诱导中和抗体的关键靶蛋白，这些抗体可以阻断病毒与宿主的相互作用并中和病毒感染性。本研究成功利用HEK293F真核表达系统表达并生产重组S1蛋白。通过定量分析，开发了五种特异性靶向PEDV重组S1蛋白的单克隆抗体（mAbs），并使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和流式细胞术（FCA）进行评估。结果表明，所有五种单克隆抗体均属于IgG1同型，其半数有效浓度（EC50）值分别为84.77、7.42、0.89、14.64和7.86 pM。这五种单克隆抗体均可用于ELISA、FCA和IFA检测PEDV感染。单克隆抗体5-F9在ELISA中具有最高灵敏度，可检测低至0.3125 ng/mL的重组PEDV-S1蛋白，而在FCA中仅需0.096 ng/mL的单克隆抗体5-F9即可检测PEDV。抗原表位分析结果表明，单克隆抗体8-G2是唯一能够识别线性表位的抗体。总之，本研究获得了高免疫原性的S1蛋白和五种特异性靶向S1蛋白的高亲和力单克隆抗体。这些发现对PEDV感染的早期检测具有重要意义，并为进一步研究病毒与宿主的相互作用奠定了坚实基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何获得针对PEDV S1蛋白的高亲和力单克隆抗体，并评估其用于PEDV感染检测的潜力？
- 核心机制
- S1蛋白亚基是诱导中和抗体的关键靶点，高亲和力抗体通过有效结合病毒表面抗原增强检测灵敏度。
- 主要证据
- 通过ELISA、IFA和FCA实验证实五种单克隆抗体均能特异性结合PEDV，其中5-F9灵敏度最高，可检测低至0.3125 ng/mL重组蛋白和0.096 ng/mL抗体浓度。
- 研究意义
- 为PEDV感染的早期检测提供高灵敏度工具，并为进一步研究病毒与宿主相互作用奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫与杂交瘤制备
产生针对S1蛋白的特异性抗体。
用重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠，三次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合，筛选阳性杂交瘤克隆。
单克隆抗体特性鉴定
确定抗体的亚型、亲和力及识别表位类型。
通过PCR测序确定抗体亚型；通过间接ELISA测定EC50；通过截短S1蛋白表达和ELISA分析表位。
抗体在PEDV检测中的应用
评估单克隆抗体在IFA和FCA中检测PEDV感染的能力。
PEDV感染Vero E6细胞，分别用五种单克隆抗体进行IFA和FCA分析，比较结合活性。
重组抗体5-F9的表达与灵敏度测试
验证5-F9作为检测试剂的敏感性和稳定性。
将5-F9重链和轻链基因克隆至pcDNA3.4，共转染HEK293F表达，蛋白A纯化；通过ELISA和FCA测定最低检测浓度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | pcDNA3.4 | Invitrogen, USA | -- |
| HEK293F细胞 | Thermo Fisher Scientific, USA | -- | |
| 蛋白纯化 | 镍离子亲和层析柱 | Cytiva, USA | -- |
| 免疫 | 弗氏完全佐剂 | Sigma-Aldrich, USA | -- |
| 弗氏不完全佐剂 | Sigma-Aldrich, USA | -- | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd., China | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries, Israel | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 抗体浓度测定 | ELISA试剂盒 | Thermo Scientific, USA | -- |
| ELISA | 抗小鼠IgG(Fab)-过氧化物酶标记山羊抗体 | Sigma-Aldrich, USA | -- |
| 抗His标签一抗 | Abcam, UK | -- | |
| TMB | Solarbio | -- | |
| 酶标仪（Epoch） | BioTek Instruments, Inc. | -- | |
| IFA | 山羊抗小鼠IgG二抗（FITC标记） | Abcam, UK | -- |
| 荧光显微镜（DMi8） | Leica Microsystems | -- | |
| 流式分析 | FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗 | Abcam, UK | -- |
| BD FCAVerse™流式细胞仪 | BD | -- | |
| 蛋白纯化（抗体） | 蛋白A亲和层析 | Cytiva, USA | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 表达细胞系、载体、标签、纯化方法 阅读提示：Methods: Recombinant PEDV-S1 protein expression and purification |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系、周龄、性别、免疫剂量、佐剂、免疫途径、免疫间隔 阅读提示：Methods: Immunization of mice |
| 杂交瘤筛选 | 融合比例、融合方法、筛选培养基、阳性判定标准 阅读提示：Methods: Selection of high-affinity mAbs |
| 抗体鉴定 | EC50测定方法、浓度范围、表位分析截短方法 阅读提示：Methods: Identification of mAb subtypes; Epitope mapping |
| 抗体应用检测 | 细胞系、感染MOI、感染时间、固定条件、染色条件 阅读提示：Methods: Indirect immunofluorescence assay; Analysis of flow cytometry |