PRP提取与细胞培养
制备活化PRP并建立PRP、FBS和对照三种培养条件,以比较PRP对cADMSCs生物学性能的影响。
从犬静脉血提取PRP,调整血小板浓度至1x10^9/mL,反复冻融4次并离心获得活化PRP。使用含10%活化PRP、10%去外泌体FBS或不含血清的α-MEM培养基培养cADMSCs。
Multiomics analysis of platelet-rich plasma promoting biological performance of mesenchymal stem cells.
包含体外细胞功能实验(增殖、克隆、迁移、衰老)、转录组学、外泌体蛋白质组学、代谢组学及体内皮肤损伤修复实验,具有多层级验证。
犬脂肪间充质干细胞(cADMSCs) 犬皮肤损伤模型
PRP浓度:1x10^8/mL(血小板浓度) 培养时间:48小时 CCK-8增殖检测:每孔10μL CCK-8,孵育1.5小时,测定450nm吸光度 Transwell迁移实验:2×10^4细胞接种于上室,24小时后计数迁移细胞 皮肤损伤实验:6只犬,每只5个直径2cm的皮肤缺损,分为5组
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
制备活化PRP并建立PRP、FBS和对照三种培养条件,以比较PRP对cADMSCs生物学性能的影响。
从犬静脉血提取PRP,调整血小板浓度至1x10^9/mL,反复冻融4次并离心获得活化PRP。使用含10%活化PRP、10%去外泌体FBS或不含血清的α-MEM培养基培养cADMSCs。
评估PRP对细胞增殖、克隆形成、迁移和衰老的影响。
通过CCK-8检测细胞增殖,结晶紫染色计数克隆形成,Transwell和细胞划痕实验检测迁移,SA-β-gal染色检测衰老。
分析PRP处理后cADMSCs的基因表达变化,寻找关键通路。
对CONT、FBS和PRP组细胞进行转录组测序,通过差异表达基因分析、GO和KEGG富集分析。
探究PRP对cADMSCs外泌体分泌功能的影响。
超速离心提取外泌体,TMT标记定量蛋白质组学分析外泌体蛋白组成和差异蛋白,并进行功能注释。
验证PRP预处理的MSC培养上清(含外泌体)对皮肤损伤的修复效果。
在犬背部制造5个圆形皮肤缺损,分别注射5种不同处理组的上清液,观察愈合率,并进行HE染色。
分析PRP处理对细胞代谢途径的影响。
对FBS和PRP组细胞进行非靶向代谢组学分析,鉴定差异代谢物并富集KEGG通路。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PRP提取 | 肝素钠抗凝剂 | WEGO | 20172410710 |
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Procell | PM150421 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Procell | PB180120 | |
| 抗支原体清除剂 | Procell | P-CMR-001 | |
| 去外泌体胎牛血清 | ViVaCell | C38010050 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Sigma-Aldrich | 96992-500TESTS-F |
| 细胞衰老检测 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| 转录组测序 | TRIzol试剂 | Thermofisher | 15596018 |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent | 5067-1511 | |
| Dynabeads Oligo (dT) | Thermo Fisher | 61002 | |
| SuperScript™ II逆转录酶 | Invitrogen | 1896649 | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | m0209 | |
| RNase H | NEB | m0297 | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher | R0133 | |
| 热不稳定尿嘧啶-DNA糖基化酶 | NEB | m0280 | |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| TMT-10plex标记试剂 | -- | -- | |
| Agilent ZORBAX 300Extend-C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| Thermo Scientific UltiMate™ 3000二元快速分离系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢组学 | ACQUITY UPLC T3色谱柱 | Waters | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| Vectaxib咀嚼片 | Orbiepharm | -- | |
| Beylide | Bayer | -- | |
| 细胞计数 | 全自动细胞分析仪 | Mindray | BC-5000 |
| 细胞计数仪 | Countstar | IC1000 | |
| 离心 | 离心机 | Xiangyi | HT165R |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | Corning | 3414 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PRP提取 | 犬静脉血来源、抗凝剂类型、离心条件(900g,4℃,5分钟;1500g,4℃,15分钟)、血小板浓度调整(1x10^9/mL)、冻融次数(4次)、离心参数(5000rpm,4℃,30分钟) 阅读提示:Methods - PRP extraction |
| 细胞培养 | 培养基成分(α-MEM基础培养基、10%活化PRP或10%去外泌体FBS、1%青霉素-链霉素、0.25%支原体清除剂)、培养时间(48小时) 阅读提示:Methods - Cell culture medium |
| 细胞功能检测 | CCK-8检测的细胞密度、孵育时间(1.5小时)和测量波长(450nm);克隆形成实验接种密度(1000细胞/孔);Transwell实验细胞数量(2×10^4)、迁移时间(24小时);划痕实验观察时间(48小时) 阅读提示:Methods - Cell culture and detection |
| 转录组测序 | RNA提取方法(TRIzol)、文库构建流程、测序平台(Illumina Novaseq 6000)、差异基因筛选阈值(|log2FC|≥1且q<0.05) 阅读提示:Methods - Transcriptome sequencing 和 Bioinformatics Analysis |
| 外泌体蛋白质组学 | 外泌体提取方法(超速离心)、TMT标记、质谱平台(Orbitrap Fusion)、差异蛋白筛选阈值(FC≥1.5且p<0.05) 阅读提示:Methods - TMT labeled quantitative proteomics |
| 代谢组学 | 细胞培养时间(48小时)、代谢物提取方法(80%甲醇)、LC-MS条件、差异代谢物筛选阈值(VIP>1) 阅读提示:Methods - Metabolite extraction and mass spectrometry analysis |
| 皮肤损伤实验 | 动物数量和规格(6只犬,2-5岁,6-8kg)、皮肤缺损直径(2cm)、分组(5组)、注射时间点(手术当天和术后5、10、15天)、观察时间点(0、5、15、25天) 阅读提示:Methods - Skin healing test |