富血小板血浆促进间充质干细胞生物学性能的多组学分析

Multiomics analysis of platelet-rich plasma promoting biological performance of mesenchymal stem cells.

作者信息Pengxiu Dai, Yi Wu, Yaxin Gao, Mengnan Li, Mingde Zhu, Haojie Xu, Xiancheng Feng, Yaping Jin, Xinke Zhang
PMID38840037
发布时间2024-06-05
DOI10.1186/s12864-024-10329-8

实验完整度

包含体外细胞功能实验(增殖、克隆、迁移、衰老)、转录组学、外泌体蛋白质组学、代谢组学及体内皮肤损伤修复实验,具有多层级验证。

主要模型

犬脂肪间充质干细胞(cADMSCs) 犬皮肤损伤模型

重点核对

PRP浓度:1x10^8/mL(血小板浓度) 培养时间:48小时 CCK-8增殖检测:每孔10μL CCK-8,孵育1.5小时,测定450nm吸光度 Transwell迁移实验:2×10^4细胞接种于上室,24小时后计数迁移细胞 皮肤损伤实验:6只犬,每只5个直径2cm的皮肤缺损,分为5组

摘要

间充质干细胞是组织修复和细胞疗法的理想种子细胞,在再生医学和组织工程中具有广阔的应用前景。使用富血小板血浆作为辅助剂,创建和改善间充质干细胞生长的微环境,可以增强间充质干细胞的生物学特性,提高细胞疗法的疗效。然而,富血小板血浆改善间充质干细胞生物学性能的机制仍不清楚。本研究通过检测富血小板血浆对间充质干细胞生物学性能的影响,结合多组学分析(转录组学、蛋白质组学和代谢组学)及相关检测,分析了富血小板血浆改善间充质干细胞生物学性能的具体途径、相关机制和代谢通路。在体外细胞培养系统中,用富血小板血浆代替胎牛血清后,间充质干细胞的生物学性能显著提高,与细胞增殖、粘附、生长、迁移和信号转导相关的基因(ESM1、PDGFB、CLEC7A、CCR1和ITGA6等)显著上调。富血小板血浆可以增强间充质干细胞外泌体的分泌功能,显著上调许多与组织修复、免疫调节和抗感染相关的蛋白质,并增强外泌体对皮肤损伤的修复效果。用富血小板血浆代替胎牛血清后,间充质干细胞发生代谢重编程,氨基酸和脂肪酸的代谢以及多种信号通路发生改变,多种蛋白质的合成代谢途径增强。这些结果为优化间充质干细胞培养体系、提高间充质干细胞的生物学特性和临床应用效果提供了理论和技术参考。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PRP如何改善间充质干细胞的生物学性能,其具体机制和代谢通路是什么?
核心机制
PRP通过上调与细胞增殖、粘附、生长、迁移和信号转导相关的基因表达,增强外泌体分泌功能,并诱导代谢重编程,改变氨基酸和脂肪酸代谢及多种信号通路,从而改善MSC生物学性能。
主要证据
体外实验显示PRP显著促进cADMSCs增殖、克隆形成和迁移,减少衰老;转录组学显示相关基因上调;外泌体蛋白质组学显示组织修复、免疫调节和抗感染相关蛋白上调;体内皮肤损伤实验显示PRP组修复效果最佳;代谢组学显示代谢重编程。
研究意义
为优化MSCs培养体系、提高MSCs生物学特性和临床应用效果提供理论和技术参考。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PRP提取与细胞培养

制备活化PRP并建立PRP、FBS和对照三种培养条件,以比较PRP对cADMSCs生物学性能的影响。

从犬静脉血提取PRP,调整血小板浓度至1x10^9/mL,反复冻融4次并离心获得活化PRP。使用含10%活化PRP、10%去外泌体FBS或不含血清的α-MEM培养基培养cADMSCs。

2

细胞生物学性能检测

评估PRP对细胞增殖、克隆形成、迁移和衰老的影响。

通过CCK-8检测细胞增殖,结晶紫染色计数克隆形成,Transwell和细胞划痕实验检测迁移,SA-β-gal染色检测衰老。

3

转录组测序与分析

分析PRP处理后cADMSCs的基因表达变化,寻找关键通路。

对CONT、FBS和PRP组细胞进行转录组测序,通过差异表达基因分析、GO和KEGG富集分析。

4

外泌体提取与蛋白质组学分析

探究PRP对cADMSCs外泌体分泌功能的影响。

超速离心提取外泌体,TMT标记定量蛋白质组学分析外泌体蛋白组成和差异蛋白,并进行功能注释。

5

皮肤损伤修复实验

验证PRP预处理的MSC培养上清(含外泌体)对皮肤损伤的修复效果。

在犬背部制造5个圆形皮肤缺损,分别注射5种不同处理组的上清液,观察愈合率,并进行HE染色。

6

代谢组学分析

分析PRP处理对细胞代谢途径的影响。

对FBS和PRP组细胞进行非靶向代谢组学分析,鉴定差异代谢物并富集KEGG通路。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
肝素钠抗凝剂WEGO20172410710
α-MEM培养基ProcellPM150421
青霉素-链霉素溶液ProcellPB180120
抗支原体清除剂ProcellP-CMR-001
去外泌体胎牛血清ViVaCellC38010050
CCK-8试剂盒Sigma-Aldrich96992-500TESTS-F
衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒BeyotimeC0602
TRIzol试剂Thermofisher15596018
RNA 6000 Nano LabChip试剂盒Agilent5067-1511
Dynabeads Oligo (dT)Thermo Fisher61002
SuperScript™ II逆转录酶Invitrogen1896649
大肠杆菌DNA聚合酶INEBm0209
RNase HNEBm0297
dUTP溶液Thermo FisherR0133
热不稳定尿嘧啶-DNA糖基化酶NEBm0280
胰蛋白酶----
TMT-10plex标记试剂----
Agilent ZORBAX 300Extend-C18色谱柱Agilent--
Thermo Scientific UltiMate™ 3000二元快速分离系统Thermo Scientific--
Orbitrap Fusion质谱仪Thermo Fisher Scientific--
ACQUITY UPLC T3色谱柱Waters--
Q Exactive质谱仪Thermo Scientific--
异氟烷----
Vectaxib咀嚼片Orbiepharm--
BeylideBayer--
全自动细胞分析仪MindrayBC-5000
细胞计数仪CountstarIC1000
离心机XiangyiHT165R
Transwell小室Corning3414

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PRP提取
犬静脉血来源、抗凝剂类型、离心条件(900g,4℃,5分钟;1500g,4℃,15分钟)、血小板浓度调整(1x10^9/mL)、冻融次数(4次)、离心参数(5000rpm,4℃,30分钟)
阅读提示:Methods - PRP extraction
细胞培养
培养基成分(α-MEM基础培养基、10%活化PRP或10%去外泌体FBS、1%青霉素-链霉素、0.25%支原体清除剂)、培养时间(48小时)
阅读提示:Methods - Cell culture medium
细胞功能检测
CCK-8检测的细胞密度、孵育时间(1.5小时)和测量波长(450nm);克隆形成实验接种密度(1000细胞/孔);Transwell实验细胞数量(2×10^4)、迁移时间(24小时);划痕实验观察时间(48小时)
阅读提示:Methods - Cell culture and detection
转录组测序
RNA提取方法(TRIzol)、文库构建流程、测序平台(Illumina Novaseq 6000)、差异基因筛选阈值(|log2FC|≥1且q<0.05)
阅读提示:Methods - Transcriptome sequencing 和 Bioinformatics Analysis
外泌体蛋白质组学
外泌体提取方法(超速离心)、TMT标记、质谱平台(Orbitrap Fusion)、差异蛋白筛选阈值(FC≥1.5且p<0.05)
阅读提示:Methods - TMT labeled quantitative proteomics
代谢组学
细胞培养时间(48小时)、代谢物提取方法(80%甲醇)、LC-MS条件、差异代谢物筛选阈值(VIP>1)
阅读提示:Methods - Metabolite extraction and mass spectrometry analysis
皮肤损伤实验
动物数量和规格(6只犬,2-5岁,6-8kg)、皮肤缺损直径(2cm)、分组(5组)、注射时间点(手术当天和术后5、10、15天)、观察时间点(0、5、15、25天)
阅读提示:Methods - Skin healing test