ADSCs细胞培养及条件培养基制备
获取ADSCs分泌因子,制备条件培养基以处理甲状腺癌细胞。
ADSCs生长至70-90%融合后,更换为含1%FBS的RPMI-1640培养基,培养1周后收集上清,过滤去除细胞碎片,加入5%FBS用于培养TPC-1/BCPAP细胞。
Human adipose-derived stem cells promote migration of papillary thyroid cancer cell via leptin pathway.
包含体外细胞实验(迁移、侵袭、增殖、Western blot)和体内动物模型,并通过中和抗体和受体拮抗剂进行功能验证。
人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1 人甲状腺乳头状癌细胞系BCPAP BALB/c裸鼠尾静脉转移模型 人脂肪间充质干细胞(ADSCs)
ADSCs来源:Cyagen Biosciences,货号HUXMD-01001 ADSC-CM收集:细胞生长至70-90%融合后,换含1%FBS的RPMI-1640培养1周 细胞处理时间:ADSC-CM孵育24小时 瘦素中和抗体浓度:10 μg/ml 动物实验:雌性BALB/c裸鼠,尾静脉注射5x10^6 TPC-1细胞,Allo-aca 1 mg/kg每日皮下注射,8周后观察
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取ADSCs分泌因子,制备条件培养基以处理甲状腺癌细胞。
ADSCs生长至70-90%融合后,更换为含1%FBS的RPMI-1640培养基,培养1周后收集上清,过滤去除细胞碎片,加入5%FBS用于培养TPC-1/BCPAP细胞。
检测ADSC-CM对甲状腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
TPC-1和BCPAP细胞用ADSC-CM或对照培养基处理24小时后,进行Transwell侵袭实验和划痕愈合实验。
检测ADSC-CM对甲状腺癌细胞增殖和活力的影响。
TPC-1和BCPAP细胞用ADSC-CM或对照培养基培养,分别用EdU实验和CCK-8实验检测增殖和活力。
验证瘦素在ADSC-CM促进甲状腺癌细胞迁移中的作用。
在ADSC-CM中加入瘦素中和抗体(NAB)处理细胞,再检测侵袭、迁移、增殖、活力和MMP-2表达。
检测ADSC-CM处理及瘦素阻断后甲状腺癌细胞中MMP-2的表达变化。
收集处理后的细胞,裂解提取蛋白,用Western blot检测MMP-2、MMP-9、Ob-R等蛋白水平。
验证瘦素受体拮抗剂对甲状腺癌细胞肺转移的影响。
将TPC-1细胞尾静脉注射裸鼠,实验组每日皮下注射Allo-aca,8周后观察肺转移结节数量和大小,并用Western blot检测甲状腺球蛋白确认结节来源。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 脂肪间充质干细胞完全培养基 | Cyagen Biosciences, Inc. | -- | |
| 0.22-μm注射器过滤器 | MilliporeSigma | -- | |
| 人脂肪间充质干细胞 | Cyagen Biosciences, Inc. | HUXMD-01001 | |
| TPC-1细胞系 | Procell Life Science & Technology, Co., Ltd. | -- | |
| BCPAP细胞系 | Procell Life Science & Technology, Co., Ltd. | -- | |
| 侵袭实验 | Transwell小室 | Corning, Inc. | -- |
| 胶原蛋白 | -- | -- | |
| 苏木素 | -- | -- | |
| 增殖实验 | EdU DNA体外增殖检测试剂 | Guangzhou RiboBio Co. Ltd. | -- |
| 荧光显示液 | Guangzhou RiboBio Co. Ltd. | -- | |
| 活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories, Inc. | -- |
| ELISA检测 | ELISA试剂盒 | FANKEL Industrial, Ltd. | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 瘦素受体抗体 | R&D Systems | MAB867 | |
| MMP-2抗体 | Cell Signaling Technology | 4022 | |
| MMP-9抗体 | Cell Signaling Technology | 3852 | |
| 甲状腺球蛋白抗体 | Abcam | ab243094 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| 山羊抗兔IgG | Abcam | ab205718 | |
| SDS-PAGE凝胶 | -- | -- | |
| 中和抗体实验 | 瘦素中和抗体 | R&D Systems, Inc. | -- |
| 动物实验 | Allo-aca | MedChemExpress | -- |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| T3 ELISA试剂盒 | FANKEL Industrial, Ltd. | -- | |
| T4 ELISA试剂盒 | FANKEL Industrial, Ltd. | -- | |
| TSH ELISA试剂盒 | FANKEL Industrial, Ltd. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ADSCs培养与条件培养基制备 | ADSCs来源、培养基、培养条件、收集时间、过滤方式 阅读提示:Materials and methods: Cell lines, flow cytometry, and cell culture; Conditioned medium |
| 体外迁移和侵袭实验 | 处理时间、细胞数量、Transwell小室规格、划痕愈合时间 阅读提示:Materials and methods: Transwell invasion assay; Wound healing assay; Results: Figure 2 |
| 体外增殖和活力实验 | 细胞接种数、处理体积、EdU和CCK-8孵育时间 阅读提示:Materials and methods: Cell proliferation assay; Cell viability assay; Results: Figure 3 |
| 瘦素通路阻断实验 | NAB浓度、处理时间、检测指标 阅读提示:Materials and methods: Leptin neutralizing antibody (NAB) experiment; Results: Figures 5-7 |
| 动物体内转移实验 | 动物品系、周龄、性别、分组、细胞注射量、给药剂量、时间、观察终点 阅读提示:Materials and methods: Animal experiment; Results: Figure 1 |