空间代谢组学分析
鉴定宫颈癌组织与正常组织间的差异代谢物，尤其脂质相关代谢物。
使用AFADESI-MSI对宫颈癌组织切片进行质谱成像，结合HE染色，提取癌、上皮、基质区域质谱，OPLS-DA和火山图筛选差异代谢物。
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空间分辨代谢组学与空间转录组学联合揭示RACK1介导脂肪酸合成的机制
Combined spatially resolved metabolomics and spatial transcriptomics reveal the mechanism of RACK1-mediated fatty acid synthesis.
实验完整度
高包含空间代谢组学、空间转录组学、细胞功能实验（增殖、凋亡）、机制验证（Co-IP、ChIP、通路抑制剂/激活剂）和临床样本相关性分析，多个独立证据层级，功能与机制验证完整。
主要模型
宫颈癌组织样本 SiHa细胞系 C-33a细胞系
重点核对
RACK1敲低（shRACK1）和SREBP1过表达（OE SREBP1）慢病毒感染，MOI=30，嘌呤霉素筛选 SC79（AKT激活剂）处理浓度10 μM，处理24小时 Fatostatin（SREBP1抑制剂）处理浓度3 μM，处理24小时 trans-C75（FASN抑制剂）处理浓度50 μM，处理24小时 PF-05175157（ACC抑制剂）处理浓度25 μM，处理24小时
摘要
在快速增殖的癌细胞中，脂质代谢发生改变，脂肪酸被用于合成鞘脂和甘油磷脂，以产生细胞膜和信号分子。活化C激酶1受体（RACK1；也称为小核糖体亚基蛋白）是一种参与信号通路的细胞内支架蛋白。这种脂质代谢是否受RACK1调控尚不清楚。在这里，整合的空间分辨代谢组学和空间转录组学揭示，宫颈癌（CC）样本中脂质积累与RACK1过表达相关，且RACK1促进了CC细胞中的脂质合成。染色质免疫沉淀验证了固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）与乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FASN）启动子的结合。RACK1通过上调固醇调节元件结合转录因子1（SREBP1）和脂肪生成基因FASN和ACC1的表达，增强从头脂肪酸合成。免疫共沉淀和蛋白质印迹显示，RACK1与蛋白激酶B（AKT）相互作用，激活AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/SREBP1信号通路，促进脂肪酸合成。细胞增殖和凋亡实验表明，RACK1调控的脂肪酸合成在CC进展中至关重要。因此，RACK1通过AKT/mTOR/SREBP1信号通路增强脂质合成，促进CC细胞生长。RACK1可能成为CC的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RACK1是否调控宫颈癌细胞中的脂肪酸合成，其分子机制是什么？
- 核心机制
- RACK1与AKT相互作用，激活AKT/mTOR信号通路，上调SREBP1表达，SREBP1直接结合ACC1和FASN启动子，促进脂肪酸合成。
- 主要证据
- 空间组学显示RACK1、ACC1、FASN和油酸在肿瘤区域共定位；Co-IP验证RACK1-AKT结合；Western blot显示RACK1敲低降低p-AKT、p-mTOR、SREBP1、ACC1和FASN，SC79可恢复；ChIP验证SREBP1结合ACC1和FASN启动子；功能实验显示抑制脂肪酸合成酶减少增殖并增加凋亡。
- 研究意义
- RACK1通过激活AKT/mTOR/SREBP1信号通路促进宫颈癌细胞脂肪酸合成和增殖，可能成为宫颈癌代谢评估和疾病进展的标志物及治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组测序
分析宫颈癌组织中基因表达的空间分布，并评估脂肪酸合成相关基因的表达。
使用10x Genomics Visium平台进行空间转录组测序，获取组织切片基因表达数据，通过UMAP聚类和差异分析识别肿瘤区域中ACC1、FASN等基因的表达。
细胞模型构建及验证
构建RACK1敲低和SREBP1过表达的宫颈癌细胞系，验证RACK1对脂肪酸合成的影响。
用慢病毒感染SiHa和C-33a细胞，嘌呤霉素筛选稳定细胞系，通过Western blot验证敲低效率。
脂肪酸合成检测
检测RACK1敲低后细胞内游离脂肪酸和中性脂质含量的变化。
利用游离脂肪酸检测试剂盒和BODIPY 493/503染色，检测细胞内游离脂肪酸水平和中性脂质含量。
机制验证
验证RACK1是否通过AKT/mTOR/SREBP1通路调控脂肪酸合成。
通过Co-IP验证RACK1与AKT相互作用，Western blot检测通路蛋白磷酸化，ChIP验证SREBP1与ACC1/FASN启动子结合，并用SC79和Fatostatin处理验证通路功能。
功能实验
评估RACK1调控的脂肪酸合成对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。
通过CCK-8、克隆形成和流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡，并使用C75和PF-05175157抑制脂肪酸合成酶。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质谱成像 | AFADESI质谱成像平台 | Beijing Victor Technology Co., LTD | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 组织切片 | 冰冻切片机（Leica CM1950） | Leica | -- |
| 空间转录组 | Visium基因表达玻片 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 脂质染色 | BODIPY 493/503荧光染料 | Invitrogen | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 显微镜成像 | 奥林巴斯FV-1000共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 凋亡检测 | BD Annexin V-EGFP试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 细胞周期检测 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | Beyotime | C1052 | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| Co-IP | 蛋白A/G磁珠 | Bimake Biotechnology | -- |
| 药物处理 | 油酸 | MedChemExpress | HY-N1446 |
| SC79 | MedChemExpress | HY-18749 | |
| Fatostatin | MedChemExpress | HY-14452 | |
| trans-C75 | MedChemExpress | HY-12364A | |
| PF-05175157 | MedChemExpress | HY-12942 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Proteintech | PF00004 |
| Multiskan FC酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | 1410101 | |
| 游离脂肪酸检测 | 游离脂肪酸检测试剂盒 | Abcam | ab65341 |
| Spark 10M多功能酶标仪 | Tecan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 质谱成像 | 组织切片厚度、溶剂组成、流速、喷雾电压、扫描速度、步长 阅读提示：2.2.1 材料和方法 |
| 空间转录组测序 | 组织切片厚度、透化时间、测序平台及读长 阅读提示：2.2.2 方法 |
| 细胞培养及慢病毒感染 | 细胞系、MOI、感染时间、筛选药物浓度 阅读提示：2.3和2.4节 |
| Western blot | 蛋白上样量、抗体信息（详见表S1）、曝光条件 阅读提示：2.5节及表S1 |
| 脂质检测 | BODIPY浓度、孵育时间、洗涤次数；游离脂肪酸检测试剂盒及步骤 阅读提示：2.6节和2.13节 |
| 药物处理 | 药物名称、浓度、处理时间 阅读提示：2.11节 |
| 细胞功能检测 | CCK-8检测时间、细胞接种密度；流式凋亡/周期检测步骤 阅读提示：2.7, 2.8, 2.12节 |