杜仲有效成分筛选及靶点预测
筛选杜仲中可能治疗心梗后心衰的活性成分并预测其作用靶点。
利用 TCMSP 数据库筛选 OB≥30%、DL≥0.18、MW<500 的活性成分；使用 PubChem 和 Open Babel 获取 SMILES 结构；通过 SwissTargetPrediction 和 TargetNet 预测成分靶点。
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杜仲中的 medioresinol 通过激活 PI3K/AKT/mTOR 通路改善心肌梗死诱导的心力衰竭：一项网络分析与实验研究。
Medioresinol from Eucommiae cortex improves myocardial infarction-induced heart failure through activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway: A network analysis and experimental study.
实验完整度
中包含网络药理学、分子对接及体外细胞实验（OGD模型），并验证了功能（细胞活力、氧化应激、炎症）和机制（PI3K/AKT/mTOR通路），但缺乏动物或临床样本验证。
主要模型
H9c2 大鼠心肌细胞系 氧糖剥夺（OGD）细胞模型
重点核对
OGD 模型建立：无糖培养基、95% N2/5% CO2 培养 6 小时 药物干预浓度：medioresinol 60 μM 和 120 μM，Wortmannin 100 nM，740 Y-P 12 μM 药物干预时间：正常培养 48 小时后药物干预 18 小时 细胞分组：Control、OGD、OGD+740 Y-P、OGD+WTM、OGD+MDRN-L、OGD+MDRN-H、OGD+MDRN-H+WTM
摘要
目的
本研究旨在通过网络分析和分子对接方法，系统分析杜仲治疗心肌梗死后心力衰竭的潜在活性成分。通过体外实验验证杜仲成分 medioresinol 通过其抗炎和抗氧化能力改善氧糖剥夺诱导的细胞损伤。
方法
使用特定数据筛选杜仲的潜在活性成分。使用瑞士生物信息学研究所数据库和 TargetNet 预测这些成分的靶点，并通过与心肌梗死和心力衰竭疾病靶点相交来鉴定关键靶点。对关键靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用分析以筛选核心靶点。使用诺华研究基金会基因组学研究所和人类蛋白质图谱鉴定心肌高表达靶点。使用注释、可视化和综合发现数据库进行京都基因与基因组百科全书和基因本体论富集分析。对最终成分和靶蛋白进行分子对接。使用经受氧糖剥夺条件的 H9c2 细胞进行体外实验，以验证筛选出的潜在活性成分的作用。
结果
网络分析显示，杜仲可能通过磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、缺氧诱导因子 1 和 Janus 激酶/信号转导与转录激活因子通路发挥其作用，这些通路对心肌收缩、血管张力调节、炎症反应和氧化应激至关重要。分子对接表明所选化合物与 PI3K、AKT 和 mTOR 稳定结合。选择 medioresinol 进行进一步研究，并证明其通过激活 PI3K/AKT/mTOR 通路，显著改善心肌缺血缺氧模型细胞的氧化应激和炎症反应。
结论
本研究证实了 PI3K/AKT/mTOR 通路在杜仲心血管保护作用中的作用，并提供了细胞水平的证据。Medioresinol 通过减少氧化应激和炎症反应，显示出对心肌梗死诱导的心力衰竭的潜在治疗作用。这些发现为杜仲在心力衰竭治疗中的应用提供了理论依据，并支持开发治疗心血管疾病的新药。未来的研究应进一步在动物模型中验证这些效应，并探索杜仲的整体疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索杜仲治疗心肌梗死后心力衰竭的潜在活性成分、靶点及机制，并验证其作用。
- 核心机制
- Medioresinol 通过激活 PI3K/AKT/mTOR 信号通路，抑制炎症反应并减少氧化应激，从而改善心肌缺血缺氧模型细胞的功能。
- 主要证据
- 网络分析预测、分子 docking 结合能分析，以及体外 OGD 模型实验证实 medioresinol 可提高细胞活力、降低 NT-proBNP、ROS、TNF-α 和 IL-1β 水平，恢复线粒体膜电位，并上调 PI3K、p-AKT 和 p-mTOR 蛋白水平。
- 研究意义
- 本研究为杜仲治疗心力衰竭提供了理论依据，并支持 medioresinol 作为治疗心血管疾病新药的潜在开发价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
疾病靶点获取及交集分析
获取心衰和心梗的疾病靶点，并与成分靶点取交集，以确定潜在作用靶点。
使用 DisGeNET 数据库检索心力衰竭和心肌梗死的靶点，与成分靶点取交集，获得共享靶点。
PPI网络构建及核心靶点筛选
构建共享靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络，并筛选核心靶点。
将共享靶点导入 String 数据库获取 PPI 数据，使用 Cytoscape 的 MCODE 插件识别核心簇，再通过 CytoHubba 插件按 Degree 和 MCC 评分筛选关键靶点。
核心靶点心肌高表达筛选及富集分析
从关键靶点中筛选在心肌高表达的蛋白，并分析其富集的通路和功能。
使用 DAVID 数据库对关键靶点进行 KEGG 和 GO 富集分析，并通过 GNF 和 HPA 数据库筛选心肌高表达蛋白。
分子对接验证
通过分子对接验证杜仲活性成分与核心靶蛋白的结合能力。
利用 AutoDock Vina 对 13 个杜仲有效成分与 5 个心肌高表达靶蛋白进行分子对接，评估结合稳定性。
体外细胞模型建立及药效验证
建立 OGD 诱导的 H9c2 细胞损伤模型，验证 medioresinol 对心衰相关指标的影响。
使用 H9c2 细胞建立 OGD 模型，设置不同分组，检测细胞活力、NT-proBNP、ROS、TNF-α、IL-1β 和线粒体膜电位等指标。
机制验证
验证 medioresinol 是否通过调控 PI3K/AKT/mTOR 通路发挥作用。
使用 Western blot 检测 PI3K, p-AKT, p-mTOR 蛋白表达水平，并使用 PI3K 抑制剂 Wortmannin 验证通路介导作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 数据库 | 中药系统药理学数据库与分析平台 | -- | -- |
| PubChem | -- | -- | |
| DisGeNET | -- | -- | |
| String | -- | -- | |
| DAVID | -- | -- | |
| 诺华研究基金会基因组学研究所 | -- | -- | |
| 人类蛋白质图谱 | -- | -- | |
| RCSB 蛋白质数据银行 | -- | -- | |
| 靶点预测 | SwissTargetPrediction | -- | -- |
| TargetNet | -- | -- | |
| 软件/工具 | Open Babel | -- | -- |
| Cytoscape | -- | -- | |
| Python | -- | -- | |
| pandas | -- | -- | |
| matplotlib | -- | -- | |
| numpy | -- | -- | |
| Gephi | -- | -- | |
| AutoDockTools | -- | -- | |
| AutoDock Vina | -- | -- | |
| PyMOL | -- | -- | |
| ImageJ | -- | -- | |
| 分析软件 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基（含碳酸氢钠 1.5g/L） | Cellverse | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| 无糖达尔伯克改良伊格尔培养基 | Cellverse | iCell-138-0001 | |
| 细胞系 | H9c2 细胞 | Procell | CL-0089 |
| 药物处理 | 740 Y-P | MCE | 1236188-16-1 |
| 渥曼青霉素 | -- | -- | |
| Medioresinol | MCE | 40957-99-1 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8 试剂盒 | Beyotime | C0038 |
| ELISA | 大鼠 NT-proBNP ELISA 试剂盒 | DreamBio | 20240408 |
| 大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 | DreamBio | 20240427 | |
| 大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒 | DreamBio | 20240423 | |
| 活性氧检测 | DCFH-DA 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime | C2006 |
| Western blot | PI3K p110 alpha 单克隆抗体 | Proteintech | 67071-1-Ig |
| 磷酸化 AKT 单克隆抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| 磷酸化 mTOR 单克隆抗体 | Proteintech | 67778-1-Ig | |
| Alpha Tubulin 单克隆抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 仪器设备 | Synergy H1 酶标仪 | BioTek | -- |
| Vert A1 倒置荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| Azure Sapphire RGBNIR 成像系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 杜仲有效成分筛选 | 筛选标准：OB≥30%，DL≥0.18，MW<500 阅读提示：Materials and methods: Screening of effective components from Eucommiae cortex |
| 靶点预测 | SwissTargetPrediction 选择 Homo sapiens；TargetNet 默认参数 (AUC≥0.7, ECFP4指纹) 阅读提示：Materials and methods: Prediction of target proteins for effective components |
| PPI 网络及关键靶点筛选 | Cytoscape MCODE 参数 (degree cutoff=2, k-core=2)；CytoHubba 按 Degree 和 MCC 排名前 15 取交集 阅读提示：Materials and methods: PPI and key targets |
| 富集分析 | DAVID 数据库；筛选标准 p-value, Bonferroni, Benjamini, FDR 均<0.05；若超过20条，保留 p 值最小的20条 阅读提示：Materials and methods: KEGG pathway enrichment analysis and GO functional enrichment analysis |
| 分子对接 | AutoDock Vina 参数：exhaustiveness=16；准备蛋白结构时去除配体、金属离子等 阅读提示：Materials and methods: Molecular docking |
| 细胞培养及 OGD 模型 | H9c2 细胞系 (Procell, CL-0089)；OGD 条件：无糖培养基，95% N2/5% CO2，37°C，6小时 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and cell model establishment |
| 药物干预 | medioresinol 浓度：60 μM (低剂量) 和 120 μM (高剂量)；Wortmannin 100 nM；740 Y-P 12 μM；药物干预 18 小时 阅读提示：Materials and methods: Cell grouping and intervention |
| Western blot | 蛋白上样量 40 μg；抗体稀释比例：PI3K (1:1000), p-AKT (1:2000), p-mTOR (1:2000), Tubulin (1:25000)；转膜条件：6% gel 25V 40分钟, 10% gel 25V 15分钟 阅读提示：Materials and methods: Western blot |