临床相关性分析
评估NRF2信号激活与HNSCC患者预后的相关性
利用TCGA数据库分析NRF2、KEAP1和CUL3基因突变频率，以及突变与下游基因表达和患者生存期的关系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
NRF2信号通过NRF2-GPX2-NOTCH3轴在头颈部鳞状细胞癌的癌症进展中发挥重要作用
NRF2 signaling plays an essential role in cancer progression through the NRF2-GPX2-NOTCH3 axis in head and neck squamous cell carcinoma.
实验完整度
高包含TCGA数据库分析、细胞系（FaDu和Detroit 562）的体外功能实验、动物移植瘤模型、患者样本的免疫组化验证，以及机制研究（RNA-seq、通路分析）。
主要模型
FaDu细胞系 Detroit 562细胞系 裸鼠异种移植瘤模型 HNSCC患者组织样本 TCGA-HNSCC队列
重点核对
NRF2敲除或敲低所用细胞系（FaDu、Detroit 562） shRNA靶序列及敲除效率验证 皮下移植瘤细胞注射量（2×10^6细胞/只） 动物模型：Nu/Nu裸鼠，6周龄，雌雄兼用 统计方法：双尾Student's t检验，P≤0.05
摘要
核因子E2相关因子2（NRF2）的激活已在多种癌症中观察到。然而，它在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）发展中的确切作用仍不明确。我们先前发现NRF2信号对于鳞状基底祖细胞的分化至关重要，而NRF2的破坏会导致基底细胞增生。在本研究中，我们揭示了HNSCC患者中NRF2活性升高与不良预后之间的相关性。我们证明NRF2促进肿瘤增殖、迁移和侵袭，这通过体外和体内研究得到证实。重要的是，NRF2增强抗氧化酶GPX2的表达，从而增强HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭特性。GPX2的激活对于通过上调NOTCH3（癌症进展的关键驱动因素）来维持癌症干细胞（CSCs）至关重要。这些结果阐明NRF2通过NRF2-GPX2-NOTCH3轴调控HNSCC进展。我们的发现提出，药理学靶向NRF2-GPX2-NOTCH3轴可能是针对HNSCC的潜在治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NRF2信号在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）进展中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- NRF2通过上调GPX2，进而维持NOTCH3表达，激活NOTCH信号通路，促进癌症干细胞特性，从而驱动HNSCC进展。
- 主要证据
- TCGA数据库显示NRF2突变与不良预后相关；细胞实验证实NRF2或GPX2敲低抑制增殖、迁移、侵袭和球体形成，并增加凋亡；动物实验证实敲低NRF2或GPX2抑制肿瘤生长；机制上，NRF2敲除降低GPX2表达，GPX2敲低降低NOTCH3表达，且临床样本显示GPX2与NOTCH3表达正相关。
- 研究意义
- 靶向NRF2-GPX2-NOTCH3轴可能为治疗NRF2激活的HNSCC提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能验证
验证NRF2对HNSCC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和干细胞特性的影响
使用CRISPR-Cas9在FaDu细胞中敲除NRF2，或用shRNA敲低Detroit 562细胞中的NRF2，然后进行细胞增殖、集落形成、球体形成、Transwell迁移侵袭、ROS检测、凋亡检测和流式细胞术分析。
动物体内验证
评估NRF2对HNSCC肿瘤生长的影响
将NRF2敲除或对照FaDu细胞皮下注射到裸鼠，监测肿瘤体积，并通过免疫组化评估Ki67表达。
下游靶基因鉴定
寻找NRF2在HNSCC中的下游靶基因
对对照和NRF2敲除FaDu细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因，并通过KEGG富集分析，发现GPX2显著下调。
机制解析
阐明GPX2调控NOTCH3信号通路的机制
通过shRNA敲低GPX2或NOTCH3，检测癌症干细胞比例，分析NOTCH通路基因表达，并验证GPX2对NOTCH3表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证癌症干细胞特性
基因编辑和敲低
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gbico | -- |
| 胎牛血清 | HATAKA | -- | |
| 青霉素-链霉素 | HATAKA | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 基因敲除 | pLentiCRISPRv2载体 | -- | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Biosharp | -- |
| 细胞增殖实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Vazyme | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | BD Pharmingen | 610968 |
| 抗NRF2抗体 | Santa Cruz | 365949 | |
| 抗GPX2抗体 | GeneTex | GTX100292 | |
| 抗NOTCH3抗体 | Abcam | ab23426 | |
| 抗NQO1抗体 | Proteintech | 67240-1-Ig | |
| 抗KEAP1抗体 | Abclonal | A1820 | |
| 二抗试剂盒 | Proteintech | PK10006 | |
| DAB显色试剂 | -- | -- | |
| RT-qPCR | RNAex Pro RNA提取试剂 | AG | -- |
| SteadyPure RNA提取试剂盒 | AG | -- | |
| Evo M-MLV逆转录预混液 | AG | -- | |
| SYBR Green Pro Taq HS qPCR试剂盒 | AG | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Mini Trans-Blot转印模块 | Bio-Rad | -- | |
| 脱脂牛奶 | -- | -- | |
| 抗NRF2抗体 | Abclonal | A3577 | |
| 抗NOTCH3抗体 | Abclonal | A13522 | |
| 抗GCLC抗体 | Abclonal | A4499 | |
| 抗NQO1抗体 | Proteintech | 67240-1-Ig | |
| 抗GPX2抗体 | Abclonal | A15999 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Bioworld | AP0060 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | ZENBIO | 511103 | |
| 山羊抗兔二抗 | ZENBIO | 511203 | |
| BeyoECL Plus化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-mCherry凋亡检测试剂 | Beyotime | -- |
| 流式分析 | Zombie Aqua活/死细胞染料 | BioLegend | -- |
| PE偶联抗CD133抗体 | BioLegend | 311104 | |
| APC偶联抗CD44抗体 | BioLegend | 338808 | |
| ALDEFLUOR检测 | ALDEFLUOR试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| 活性氧检测 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（FaDu、Detroit 562）来源、培养基（DMEM）、10% FBS、1%青霉素-链霉素、37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| 基因敲除/敲低 | NRF2敲除使用CRISPR-Cas9（pLentiCRISPRv2），敲低使用shRNA；具体序列、转染试剂Lipofectamine 3000 阅读提示：Materials and methods, Generation of NRF2KO, NRF2KD, GPX2KD, NOTCH3KD cell lines |
| 细胞增殖实验 | CCK-8实验：细胞密度1500细胞/孔，培养时间点，490nm吸光度 阅读提示：Materials and methods, Cell growth assay |
| 集落形成实验 | 细胞密度1000细胞/孔，培养约2周，结晶紫染色 阅读提示：Materials and methods, Colony formation assay |
| Transwell实验 | 细胞密度（侵袭1×10^5，迁移5×10^4），基质胶包被，培养48小时 阅读提示：Materials and methods, Transwell assay |
| 3D球体形成 | 单细胞3000细胞/孔，80%基质胶，培养14天 阅读提示：Materials and methods, 3D sphere formation |
| 凋亡检测 | Annexin V-mCherry染色15分钟，Zombie Aqua排除死细胞，流式分析 阅读提示：Materials and methods, Cell apoptosis measurement |
| 流式分析（CSC） | CD44或CD133抗体染色，ALDEFLUOR试剂盒，DEAB阴性对照 阅读提示：Materials and methods, Flow cytometric analysis, ALDEFLUOR assays |
| 免疫组化 | 一抗稀释度（Ki67 1:1000，NRF2 1:50，GPX2 1:1000，NOTCH3 1:1000，NQO1 1:10000，KEAP1 1:200），二抗试剂盒，DAB显色 阅读提示：Materials and methods, Immunohistochemistry |
| Western blot | 一抗稀释度（NRF2 1:1000，NOTCH3 1:1000，GCLC 1:1000，NQO1 1:10000，GPX2 1:1000，β-ACTIN 1:2000），二抗稀释度（1:5000） 阅读提示：Materials and methods, Western blot |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、逆转录试剂、SYBR Green qPCR试剂、内参ACTB 阅读提示：Materials and methods, Quantitative real-time PCR |
| 动物实验 | Nu/Nu裸鼠（6周龄），皮下注射2×10^6细胞，肿瘤体积测量公式，约30-36天处死 阅读提示：Materials and methods, Xenograft model |