临床样本中ThPOK和STPG1的表达分析
检测胃癌组织和正常组织中ThPOK和STPG1的表达差异。
收集胃癌患者的胃癌组织（n=21）和配对的癌旁正常组织（n=21），通过RT-qPCR和Western blot检测ThPOK的表达，通过RT-qPCR检测STPG1的表达，并分析ThPOK表达与临床特征（包括T分期）的关系。
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ThPOK通过诱导STPG1失活ERK通路抑制胃癌细胞的免疫逃逸
ThPOK inhibits the immune escape of gastric cancer cells by inducing STPG1 to inactivate the ERK pathway.
实验完整度
中包含RT-qPCR、Western blot、CCK-8、流式细胞术、ChIP、荧光素酶报告实验及细胞共培养功能验证，但缺乏动物模型等体内验证。
主要模型
胃癌细胞系（HGC-27、SNU-1） 正常胃黏膜细胞系（GES-1） 胃癌患者组织样本及邻近正常组织（n=21） 健康对照来源的CD3+ T细胞
重点核对
ThPOK mRNA和蛋白水平在胃癌组织（n=21）和细胞（HGC-27、SNU-1）中的表达，并与正常对照比较 ThPOK过表达后胃癌细胞活力（CCK-8）及与T细胞共培养后CD3+ T细胞增殖和IFN-γ+ T细胞比例 ThPOK与STPG1启动子的结合：ChIP和荧光素酶报告实验 STPG1过表达对胃癌细胞活力和T细胞活化的影响 ThPOK和STPG1过表达后p-ERK-1/2蛋白水平及p-ERK-1/2/ERK-1/2比值的检测
摘要
背景：胃癌是全球第二大常见恶性肿瘤。弱免疫原性帮助癌细胞逃避免疫清除并生长为主要亚群。本研究旨在探讨锌指和BTB结构域包含7B（Zbtb7b，别名ThPOK）对与胃癌细胞共培养后T细胞活化的影响。方法：采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）实验检测胃癌细胞的活力。流式细胞术分析用于检测与胃癌细胞（HGC-27、SNU-1）共孵育的CD3+ T细胞的增殖和活化IFN-γ+ T细胞的比例。通过ChIP和荧光素酶报告实验探讨了ThPOK与其靶标精子尾部PG富集重复序列1（STPG1）启动子之间的结合。使用RT-qPCR定量相对基因表达。结果：ThPOK在胃癌组织和细胞中的mRNA和蛋白水平均低表达。ThPOK表达较低的胃癌患者预后较差。ThPOK过表达抑制了胃癌细胞活力并增加了T细胞活化。ThPOK作为STPG1的转录因子。STPG1在胃癌组织和细胞中也低表达。ThPOK正调控胃癌细胞中STPG1的mRNA和蛋白水平。此外，ThPOK被证明与STPG1启动子结合。STPG1上调也对胃癌细胞活力和T细胞活化产生抑制作用。此外，ThPOK和STPG1被揭示可失活胃癌细胞中的ERK通路。结论：ThPOK通过诱导STPG1失活ERK通路，抑制胃癌细胞活力并增加T细胞活化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ThPOK在胃癌中的表达及其对胃癌细胞免疫逃逸的调控机制是什么？
- 核心机制
- ThPOK作为转录因子诱导STPG1表达，进而失活ERK信号通路，抑制胃癌细胞活力并增加T细胞活化。
- 主要证据
- RT-qPCR和Western blot显示ThPOK和STPG1在胃癌组织和细胞中低表达；CCK-8显示过表达ThPOK或STPG1降低胃癌细胞活力；流式显示促进CD3+ T细胞增殖和IFN-γ+ T细胞比例；ChIP和荧光素酶实验证明ThPOK结合STPG1启动子；Western blot显示p-ERK-1/2水平下降。
- 研究意义
- 为胃癌治疗提供新线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ThPOK对胃癌细胞活力和T细胞活化的影响（功能获得实验）
验证ThPOK过表达是否影响胃癌细胞活力和T细胞活化。
在HGC-27和SNU-1细胞中转染pcDNA3.1-ThPOK（OE-ThPOK）或空载体（OE-NC），通过RT-qPCR确认过表达效率；通过CCK-8检测细胞活力；将转染后的胃癌细胞与CD3+ T细胞共培养，通过流式细胞术检测T细胞增殖和IFN-γ+ T细胞比例。
ThPOK对STPG1的转录调控验证
验证ThPOK是否转录调控STPG1表达并直接结合其启动子。
在胃癌细胞中敲低ThPOK（sh-ThPOK#1/2）或对照（sh-NC），通过RT-qPCR和Western blot检测STPG1表达；通过荧光素酶报告实验检测STPG1启动子活性；通过ChIP实验检测ThPOK与STPG1启动子的结合。
STPG1对胃癌细胞活力和T细胞活化的影响
验证STPG1过表达是否抑制胃癌细胞活力并促进T细胞活化。
在HGC-27和SNU-1细胞中转染pcDNA3.1-STPG1（OE-STPG1）或空载体（OE-NC），通过RT-qPCR确认过表达效率；通过CCK-8检测细胞活力；将转染后的胃癌细胞与CD3+ T细胞共培养，通过流式细胞术检测T细胞增殖和IFN-γ+ T细胞比例。
ThPOK和STPG1对ERK信号通路的影响
验证ThPOK和STPG1是否失活ERK通路。
通过Western blot检测胃癌细胞中p-ERK-1/2和ERK-1/2的蛋白水平，分别比较过表达ThPOK或STPG1与对照的差异；另外，检测与T细胞共培养后ERK磷酸化水平的变化。
STPG1敲低对ThPOK功能的回复实验
验证ThPOK的作用是否依赖STPG1。
在胃癌细胞中转染OE-NC、OE-ThPOK或OE-ThPOK+sh-STPG1，通过CCK-8检测细胞活力，通过流式细胞术检测与T细胞共培养后的T细胞增殖和IFN-γ+ T细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom | -- | |
| T细胞分离与共培养 | 红细胞裂解液 | -- | -- |
| T细胞共培养 | 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 | Beijing Solabio Life Sciences Co., Ltd | -- |
| 重组人白细胞介素-2 | -- | -- | |
| 抗CD3抗体 | -- | -- | |
| 抗CD28抗体 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- |
| SYBR Premix ExTaq II试剂盒 | Takara | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Pierce | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗ThPOK抗体 | Abcam | ab228680 | |
| 抗STPG1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-49489 | |
| 抗磷酸化ERK-1/2抗体 | Abcam | 44-680G | |
| 抗ERK-1/2抗体 | Abcam | ab184699 | |
| 增强化学发光检测系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | Dojindo | -- |
| 酶标仪 | Reagen | -- | |
| 流式细胞术 | PerCP标记抗CD3抗体 | -- | -- |
| Pacific blue标记抗IFN-γ抗体 | -- | -- | |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | PGL3载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- | |
| ChIP实验 | ChIP实验试剂盒 | Upstate Biotechnology | -- |
| 甲醛 | Thermo Fisher | -- | |
| DNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 胃癌组织和配对正常组织的来源、样本量（n=21）、样品处理（立即液氮冷冻） 阅读提示：见Material and methods中的Sample collection部分（图3A） |
| 细胞培养 | 胃癌细胞系（HGC-27、SNU-1）和正常胃黏膜细胞（GES-1）的培养条件（DMEM、10%FBS、1%青霉素/链霉素） 阅读提示：见Material and methods中的Cell culture部分 |
| T细胞分离与共培养 | CD3+ T细胞分离方法、共培养比例（5:1）、rhIL-2浓度（20 IU/mL）、anti-CD3（2 μg/mL）和anti-CD28（1 μg/mL）浓度 阅读提示：见Material and methods中的Isolation and identification of T cells及In vitro cell co-culture部分 |
| 细胞转染 | 转染质粒（OE-ThPOK、OE-STPG1、sh-ThPOK#1/2、sh-STPG1、sh-NC）、转染试剂（Lipofectamine 3000）和转染时间（48小时） 阅读提示：见Material and methods中的Cell transfection部分 |
| RT-qPCR | 引物序列、内参基因（GAPDH）、计算方法（2−ΔΔCt） 阅读提示：见Material and methods中的RT-qPCR部分 |
| Western blot | 抗体及稀释比例（anti-ThPOK 1:500、anti-STPG1 1:2000、anti-p-ERK-1/2 1:1000、anti-ERK-1/2 1:10000）、参考蛋白（GAPDH） 阅读提示：见Material and methods中的Western blotting部分 |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测的细胞密度（1000细胞/孔）、检测时间点（0、24、48、72小时）、CCK-8孵育时间（4小时） 阅读提示：见Material and methods中的Cell counting kit-8 assay部分 |
| 流式细胞术 | 检测的标记（PerCP-CD3、Pacific blue-IFN-γ）、仪器（BD FACSCanto II） 阅读提示：见Material and methods中的Flow cytometry analysis部分 |
| 荧光素酶报告实验 | 载体（PGL3）、转染的质粒（sh-ThPOK#1/2或sh-NC）、转染时间（48小时） 阅读提示：见Material and methods中的Luciferase reporter assay部分 |
| ChIP实验 | 交联时间（10分钟）、抗体（anti-ThPOK或anti-IgG） 阅读提示：见Material and methods中的Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay部分 |
| 统计分析 | 统计方法（Student's t-test、ANOVA、Kaplan-Meier）、显著性水平（p<0.05） 阅读提示：见Material and methods中的Statistical analysis部分 |