Functional mechanism of hsa-miR-128-3p in epithelial-mesenchymal transition of pancreatic cancer cells via ZEB1 regulation.
研究包含细胞系表达分析、过表达/敲低功能实验、双荧光素酶靶向验证及拯救实验，但缺乏动物实验和临床样本验证。
人胰腺癌细胞系PANC-1 人胰腺癌细胞系AsPC-1 人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6c7 人胰腺癌细胞系BxPC-3 人胰腺癌细胞系CFPAC-1
细胞系选择：PANC-1（间质表型、miR-128-3p低表达）和AsPC-1（上皮表型、miR-128-3p相对高表达） 转染效率验证：RT-qPCR和Western blot确认miR-128-3p mimic/inhibitor及si-ZEB1/oe-ZEB1的转染效果 靶向关系验证：双荧光素酶报告基因实验（ZEB1-WT和ZEB1-MUT）证实miR-128-3p与ZEB1 3'UTR结合 拯救实验：oe-ZEB1与miR-128-3p mimic共转染PANC-1，si-ZEB1与miR-128-3p inhibitor共转染AsPC-1，观察EMT、侵袭和迁移变化
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
选择不同恶性程度和EMT表型的胰腺癌细胞系，检测miR-128-3p和ZEB1的表达及细胞形态特征。
选取正常胰腺导管上皮细胞HPDE6c7和四种胰腺癌细胞系（AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1），通过显微镜观察细胞形态，Western blot检测E-cadherin和N-cadherin表达以确定EMT表型，RT-qPCR和Western blot检测miR-128-3p和ZEB1表达。
验证miR-128-3p对胰腺癌细胞EMT、侵袭和迁移的影响。
在PANC-1细胞中转染miR-128-3p mimic（过表达），在AsPC-1细胞中转染miR-128-3p inhibitor（敲低），通过Western blot和细胞荧光染色检测EMT标志物，通过Transwell实验检测侵袭和迁移能力。
验证ZEB1对胰腺癌细胞EMT、侵袭和迁移的影响。
在PANC-1细胞中转染si-ZEB1（敲低），在AsPC-1细胞中转染oe-ZEB1（过表达），检测EMT标志物、侵袭和迁移能力。
验证miR-128-3p是否直接靶向ZEB1。
利用TargetScan数据库预测结合位点，构建ZEB1-WT和ZEB1-MUT双荧光素酶报告质粒，与miR-128-3p mimic或inhibitor共转染，检测荧光强度；并通过RT-qPCR和Western blot检测ZEB1表达变化。
验证miR-128-3p是否通过ZEB1调控EMT、侵袭和迁移。
在PANC-1细胞中共转染miR-128-3p mimic和oe-ZEB1，在AsPC-1细胞中共转染miR-128-3p inhibitor和si-ZEB1，检测EMT标志物、侵袭和迁移能力。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific | Thermo | |
| 光学显微镜 | Olympus | CX23 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Yita | YT1317 |
| miR-128-3p模拟物 | Biomics Biotech | -- | |
| miR-128-3p抑制剂 | Biomics Biotech | -- | |
| oe-ZEB1慢病毒 | Biomics Biotech | -- | |
| si-ZEB1 | Biomics Biotech | -- | |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Bioscience | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 双荧光素酶实验 | Psicheck报告基因质粒 | GenePharma | -- |
| RT-qPCR | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | Vazyme | R401-01 |
| Taqman MicroRNA逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| PCR仪 | ABI | ABI | |
| Western blot | 放射免疫沉淀裂解缓冲液 | SORFA | SS0501 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Acmec | PC0020-500 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab40772 | |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab207608 | |
| 抗ZEB1抗体 | Abcam | ab203829 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Abcam | ab7090 | |
| 增强化学发光试剂 | -- | -- | |
| Image-Pro 6.0图像分析软件 | -- | -- | |
| 细胞荧光染色 | 抗E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab40772 |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab18203 | |
| Alexa Fluor 488荧光染料 | Abcam | ab150077 | |
| Alexa Fluor 594荧光染料 | Abcam | ab195889 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| 抗荧光淬灭封片液 | Beyotime | P0131-5mL | |
| 荧光显微镜 | Olympus | CKX53 | |
| 统计分析 | SPSS 21.0统计软件 | IBM | -- |
| GraphPad Prism 8.0软件 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（HPDE6c7, AsPC-1, BxPC-3, CFPAC-1, PANC-1）；培养基（DMEM）和添加剂（10% FBS, 1%青霉素-链霉素）；培养条件（37°C, 5% CO2）；传代比例和周期（0.25%胰蛋白酶，每3天传代） 阅读提示：Methods中的Cell culture部分 |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）；转染浓度（文中未明确说明最佳浓度）；转染时间（48小时）；质粒/寡核苷酸来源（Biomics Biotech）；分组设置（PANC-1: blank, miR-mimic NC, miR-mimic, si-NC, si-ZEB1, miR-mimic+oe-NC, miR-mimic+oe-ZEB1；AsPC-1: blank, miR-inhi NC, miR-inhi, oe-NC, oe-ZEB1, miR-inhi+si-NC, miR-inhi+si-ZEB1） 阅读提示：Methods中的Cell grouping and transfection部分 |
| Transwell实验 | 细胞密度（1×10^5 cells/mL）；接种体积（200 μL）；基质胶处理（Matrigel 60 mg/well）；孵育时间（48小时）；染色（0.1%结晶紫，10分钟）；计数方法（每孔随机3个视野） 阅读提示：Methods中的Transwell assay部分 |
| 双荧光素酶实验 | 报告质粒（ZEB1-WT, ZEB1-MUT）；共转染组合（PANC-1与miR-128-3p mimic，AsPC-1与miR-128-3p inhibitor）；转染后检测时间（48小时）；荧光素酶活性检测方法 阅读提示：Methods中的Dual-luciferase assay部分 |
| RT-qPCR | 引物序列（见表1）；内参（U6, β-actin）；PCR条件（95°C预变性10分钟，40个循环：90°C 10秒，60°C 20秒，72°C 30秒）；表达计算方法（2^-ΔΔCT） 阅读提示：Methods中的Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction部分及Table 1 |
| Western blot | 抗体信息及稀释比例：E-cadherin (1:10000, ab40772), N-cadherin (1:1000, ab207608), ZEB1 (1:1000, ab203829), β-actin (1:1000, ab8227), 二抗 (1:300, ab7090)；蛋白提取和定量（RIPA裂解液，BCA定量）；封闭条件（5%脱脂牛奶，1小时）；孵育条件（一抗4°C过夜，二抗1小时） 阅读提示：Methods中的Western blot部分 |
| 细胞荧光染色 | 固定（4%多聚甲醛15分钟）；通透（0.1% Triton X-100 10分钟）；封闭（10%山羊血清30分钟）；一抗孵育（E-cadherin 1:10000, N-cadherin 1:200, 4°C过夜）；二抗（Alexa Fluor 488 1:1000, Alexa Fluor 594 1:200, 室温2小时避光）；核染（DAPI） 阅读提示：Methods中的Cell fluorescence staining部分 |
