临床样本中circ-ERBB2表达与预后分析
检测circ-ERBB2在TNBC组织中的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系。
收集46例TNBC和配对癌旁组织，qRT-PCR检测circ-ERBB2表达；分析其与TNM分期、淋巴结转移等的关系；Kaplan-Meier分析评估总生存期；同时在TNBC细胞系中检测表达。
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环状RNA circ-ERBB2通过microRNA 136-5p/丙酮酸脱氢酶激酶4轴增强Warburg效应并促进三阴性乳腺癌生长
Circular RNA circ-ERBB2 Elevates the Warburg Effect and Facilitates Triple-Negative Breast Cancer Growth by the MicroRNA 136-5p/Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4 Axis.
实验完整度
高包含临床组织样本表达与预后分析、体外细胞功能实验、代谢表型检测、双荧光素酶和RIP验证分子结合、体内异种移植瘤模型等至少两个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468 MCF10A正常乳腺上皮细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 46例TNBC患者组织样本
重点核对
46例TNBC及配对癌旁组织中circ-ERBB2表达 si-circ-ERBB2#1和si-circ-ERBB2#2敲低circ-ERBB2 miR-136-5p mimics或inhibitor处理 PDK4过表达质粒转染 Xenograft实验中5周龄雌性BALB/c裸鼠皮下注射1×10^7 MDA-MB-231细胞
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性乳腺癌组织学亚型。据报道，环状RNA（circRNA）circ-ERBB2（circBase标识符hsa_circ_0007766）主要分布在TNBC细胞的细胞质中，并促进TNBC细胞的增殖和侵袭。本研究旨在探讨circ-ERBB2调控TNBC进展的分子机制。通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测circ-ERBB2的表达。进行功能缺失实验以研究circ-ERBB2在TNBC细胞体外和体内的功能。通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀（RIP）或RNA pull-down实验调查circ-ERBB2的调控机制。我们观察到circ-ERBB2在TNBC中过表达，且circ-ERBB2高表达的TNBC患者预后不良。功能上，circ-ERBB2敲低在体内抑制TNBC生长，降低Warburg效应，加速凋亡，并在体外抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭。机制上，circ-ERBB2海绵吸附microRNA 136-5p（miR-136-5p）以升高丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）表达。总之，circ-ERBB2通过miR-136-5p/PDK4通路至少部分促进了TNBC细胞的Warburg效应和恶性程度。本研究支持circ-ERBB2作为TNBC的预后指标。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circ-ERBB2在TNBC中是否通过调控特定miRNA和下游靶基因影响Warburg效应和肿瘤生长？
- 核心机制
- circ-ERBB2作为ceRNA海绵吸附miR-136-5p，解除miR-136-5p对PDK4的抑制作用，从而上调PDK4表达，增强Warburg效应并促进TNBC恶性进展。
- 主要证据
- 体外功能缺失显示circ-ERBB2敲低抑制增殖、迁移、侵袭并促进凋亡，降低ECAR、葡萄糖消耗和乳酸产生，升高OCR；双荧光素酶报告和RIP实验证实circ-ERBB2与miR-136-5p直接结合，miR-136-5p靶向PDK4；体内异种移植实验显示circ-ERBB2敲低抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 本研究首次揭示circ-ERBB2通过miR-136-5p/PDK4通路促进TNBC的Warburg效应和生长，提出circ-ERBB2可能作为TNBC的预后生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circ-ERBB2敲低对TNBC细胞恶性表型和代谢的影响
验证circ-ERBB2对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及Warburg效应的功能影响。
使用si-circ-ERBB2转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，通过集落形成、MTT、流式凋亡、划痕和Transwell实验检测细胞功能；用XF96分析ECAR和OCR；检测葡萄糖消耗和乳酸产生。
验证circ-ERBB2与miR-136-5p的直接结合
确认circ-ERBB2是否作为ceRNA海绵吸附miR-136-5p。
通过circinteractome、circBank和starbase预测miRNAs；用双荧光素酶报告实验检测wt/mut circ-ERBB2与miR-136-5p的相互作用；RIP实验检测Ago2富集；RNA pulldown实验检测circ-ERBB2与Bio-miR-136-5p的结合。
miR-136-5p对TNBC细胞功能和代谢的调控及PDK4的靶向验证
验证miR-136-5p是否通过靶向PDK4影响TNBC细胞的Warburg效应和恶性表型。
通过starbase预测PDK4为miR-136-5p靶基因；用双荧光素酶报告实验验证miR-136-5p与PDK4 3'UTR结合；Western blot检测PDK4蛋白水平；通过miR-136-5p mimic/inhibitor和PDK4过表达进行拯救实验，检测细胞功能、ECAR/OCR等。
circ-ERBB2敲低对体内肿瘤生长的影响
验证circ-ERBB2在体内对TNBC肿瘤生长的影响。
使用稳定表达sh-circ-ERBB2或sh-NC的MDA-MB-231细胞皮下注射裸鼠，监测肿瘤体积和重量，并在肿瘤组织中检测circ-ERBB2、miR-136-5p、PDK4、PCNA、MMP9、cleaved caspase 3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| Leibovitz's L-15培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Lipofectamine 3000试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qRT-PCR | MagNA Pure compact RNA提取试剂盒 | Roche | -- |
| Paris试剂盒 | Ambion | -- | |
| RNase R | Epicentre Technologies | -- | |
| SYBR green预混试剂盒 | Roche | -- | |
| Transcriptor高保真cDNA合成试剂盒 | Roche | -- | |
| miRcut Plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Tiangen | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞增殖检测试剂盒I | Roche | -- |
| 结晶紫 | Sigma | -- | |
| MTT试剂 | -- | -- | |
| 细胞凋亡 | 膜联蛋白V-FITC-PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 细胞迁移 | 尼康显微镜（Eclipse E600） | Nikon Instruments | -- |
| 细胞侵袭 | Transwell侵袭小室 | Costar | 354480 |
| 代谢检测 | Seahorse XF96糖酵解分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| XF糖酵解压力测试试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Sigma | -- | |
| 比色法乳酸检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| 双荧光素酶报告 | pmirGLO荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| 荧光素酶检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| anti-Ago2抗体 | -- | -- | |
| anti-IgG抗体 | -- | -- | |
| TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA pulldown | C-1磁珠 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| QuantiPro BCA蛋白定量试剂盒 | Sigma | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| PDK4抗体 | Abcam | ab115777 | |
| PCNA抗体 | Abcam | ab18197 | |
| cleaved caspase 3抗体 | Abcam | ab2302 | |
| MMP9抗体 | Abcam | ab38898 | |
| β-actin抗体 | Abcam | ab115777 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab205718 | |
| 增强化学发光底物 | PerkinElmer | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Vital River Laboratory | -- |
| 数据处理 | SPSS | SPSS Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系培养基种类（BT549用RPMI1640，MDA-MB-231等用L-15），血清和双抗浓度，培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods，细胞培养部分 |
| qRT-PCR | 内参基因（U6或β-actin），引物序列，环状RNA检测是否使用RNase R处理，Act D浓度（2 mg/ml）和处理时间 阅读提示：Materials and Methods，定量实时PCR部分；Table 2引物序列 |
| 功能实验 | siRNA序列及转染试剂，细胞接种密度（集落形成5×10^2，MTT 5×10^4，迁移5×10^5，侵袭1×10^5），处理时间（划痕24h，侵袭24h） 阅读提示：Materials and Methods，瞬时转染、增殖分析、流式、迁移和Transwell部分 |
| 代谢检测 | ECAR和OCR使用Seahorse XF96分析仪及专用试剂盒，葡萄糖消耗和乳酸产生试剂盒以及计算方式 阅读提示：Materials and Methods，ECAR和OCR测量、葡萄糖消耗和乳酸产生部分 |
| 分子机制验证 | 双荧光素酶报告质粒构建（wt/mut circ-ERBB2或PDK4 3'UTR），miR-136-5p mimics/inhibitor序列，RIP实验抗体（Ago2和IgG） 阅读提示：Materials and Methods，双荧光素酶报告、RIP、RNA pulldown部分 |
| 体内实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）年龄和性别，细胞注射数量（1×10^7），肿瘤体积计算公式，终点时间（30天） 阅读提示：Materials and Methods，动物实验部分 |
| 统计分析 | 实验重复次数（3次，每次三重复），统计检验方法（t检验或方差分析），显著性水平（P<0.05） 阅读提示：Materials and Methods，统计分析部分 |