成对sgRNA文库构建与筛选
系统鉴定使癌细胞对MAPKi敏感的基因相互组合
构建包含84个基因的成对sgRNA文库（>40,000组合），感染Cas9-A375细胞，用维莫非尼或DMSO处理10天，通过深度测序计算ρ分数和GI分数。
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系统筛选揭示克服癌细胞MAPK抑制剂耐药性的协同相互作用
Systematic screening reveals synergistic interactions that overcome MAPK inhibitor resistance in cancer cells.
实验完整度
高文献包含体外细胞筛选（成对sgRNA文库）、功能验证（竞争性生长、细胞活力、球体形成）、机制研究（Co-IP、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光）以及临床样本分析（IHC/IF）等多个证据层级，具备明确的功能和机制验证。
主要模型
A375黑色素瘤细胞（BRAFV600E突变） MeWo黑色素瘤细胞 MHCC97H肝癌细胞、H1299肺癌细胞和MCF7乳腺癌细胞 黑色素瘤患者肿瘤组织样本
重点核对
筛选模型：Cas9-A375细胞感染成对sgRNA文库，MOI=0.3，嘌呤霉素筛选，维莫非尼或DMSO处理10天 药物处理：A375细胞用2μM维莫非尼、2μM维莫非尼+10nM曲美替尼、5μM达拉非尼、5μM达拉非尼+100nM曲美替尼处理 基因敲低：siHDGF和siLGR5转染A375、H1299、MHCC97H细胞，浓度100pmol 竞争性生长实验：细胞混合培养，维莫非尼或DMSO处理长达12天 小分子抑制实验：A375细胞接种于96孔板，药物组合处理2天，通过Hoechst/PI染色计数活细胞
摘要
目的：迫切需要有效的辅助治疗策略来克服MAPK抑制剂（MAPKi）耐药性，这是多种癌症中出现的最常见的耐药形式之一。在此，我们旨在系统性地识别MAPKi耐药性背后的遗传相互作用，并进一步研究产生协同MAPKi耐药性的遗传相互作用的机制。方法：我们进行了全面的基于成对sgRNA的高通量筛选试验，以识别使癌细胞对MAPKi敏感的协同相互作用，并通过竞争性生长、细胞活力和球体形成试验验证了3种遗传组合。接下来，我们基于癌症基因组图谱数据库进行了Kaplan-Meier生存分析，并进行了免疫组织化学以确定这些协同组合的临床相关性。我们还通过免疫共沉淀、Western blot、qRT-PCR和免疫荧光试验研究了这些已验证的协同组合的MAPKi耐药机制。结果：我们构建了MAPKi耐药性的系统性相互作用网络，并确定了3种有效靶向MAPKi耐药性的新型协同组合（ITGB3+IGF1R、ITGB3+JNK和HDGF+LGR5）。接下来，我们分析了它们的临床相关性以及它们使癌细胞对MAPKi暴露敏感的机制。具体来说，我们发现了一种新的蛋白复合物HDGF-LGR5，它能够适应性响应MAPKi以增强癌细胞干性，该复合物可被ITGB3+JNK或ITGB3+IGF1R的抑制剂上调或下调。结论：成对sgRNA文库筛选为阐明癌细胞中的MAPKi耐药性提供了系统性见解。靶向ITGB3和IGF1R的药物（西仑吉肽+林西替尼）可作为抑制HDGF-LGR5蛋白复合物适应性形成的有效疗法，该复合物在MAPKi应激期间增强了癌症干性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MAPK抑制剂耐药性中，哪些基因间的遗传相互作用能协同增敏癌细胞，其机制和临床相关性如何？
- 核心机制
- HDGF与LGR5形成蛋白复合物，在MAPKi应激下适应性增强癌症干性（通过上调CD133、BMI1、KLF4/SOX2等干性标志物）并维持细胞存活，导致耐药。
- 主要证据
- 基于成对sgRNA文库筛选出3个协同组合，通过竞争性生长、细胞活力、球体形成、Co-IP、Western blot、免疫荧光等实验验证；并通过临床样本IHC/IF和TCGA生存分析证实临床相关性。
- 研究意义
- 研究为理解MAPKi耐药机制提供了系统性见解，并提示ITGB3+IGF1R靶向药物（西仑吉肽+林西替尼）可作为抑制HDGF-LGR5复合物形成的有效治疗策略，为克服耐药提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选基因组合的验证
验证筛选出的候选基因组合对MAPKi敏感性的影响
构建单基因或双基因敲除的Cas9-A375细胞系，进行竞争性生长实验和小分子抑制实验。
协同增敏机制研究
探究药物组合（cilengitide+linsitinib和cilengitide+JNK-IN-8）协同增敏MAPKi的分子机制
用qRT-PCR检测E-cadherin和vimentin mRNA水平；用Western blot检测phospho-ERK1/2、β-catenin、cleaved caspase-3等蛋白水平。
临床相关性分析
评估候选基因组合在黑色素瘤患者中的临床意义
基于TCGA和ICGC数据库进行Kaplan-Meier生存分析；对黑色素瘤患者组织样本进行IHC和IF染色，分析ITGB3、IGF1R、HDGF、LGR5等表达。
HDGF-LGR5复合物功能验证
验证HDGF与LGR5形成复合物并响应MAPKi应激，增强癌症干性
通过免疫共沉淀验证HDGF-LGR5相互作用；通过Western blot检测干性标志物（CD133、BMI1等）表达；通过免疫荧光检测KLF4/SOX2定位和核FAK。
球体形成实验
评估HDGF和LGR5双敲低联合MAPKi对肿瘤球形成能力的影响
在超低附着96孔板中培养A375、H1299和MHCC97H细胞，形成球体，并用siRNA敲低HDGF和LGR5，加入MAPKi，用AnaSP和ReViSP分析球体参数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选基因相互作用
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | -- | |
| BsaI限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| Esp3I限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺（PEI） | Polysciences | -- |
| 细胞培养筛选 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞活力检测 | Hoechst/碘化丙啶双染系统 | Solarbio | -- |
| 细菌培养 | 卡那霉素 | -- | -- |
| 壮观霉素 | -- | -- | |
| 细胞培养去除支原体 | 支原体去除剂 | Solarbio | -- |
| 药物处理 | 维莫非尼 | Selleck | -- |
| 西仑吉肽 | Selleck | -- | |
| 林西替尼 | Selleck | -- | |
| JNK-IN-8 | Selleck | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Beyotime Biotechnology | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR预混液 | Thermal Fisher Scientific | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 化学发光检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | PrimeScript RT预混液 | Takara | -- |
| 2× Taq PCR预混液 | Syngentech | -- | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | Dojindo Molecular Technologies | -- |
| 荧光成像 | A1共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 流式分析 | LSRII Fortessa流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 成对sgRNA文库筛选 | Cas9-A375细胞感染MOI、嘌呤霉素浓度、维莫非尼处理时间和浓度、文库覆盖度（~1000倍） 阅读提示：Materials and Methods: Lentivirus production and library screening；Figure 1A |
| 竞争性生长实验 | 细胞混合比例、维莫非尼浓度（2μM）、处理时间（12天）、FACS检测事件数 阅读提示：Materials and Methods: Cell growth competition assays；Figure 2D-E |
| 小分子抑制实验 | 药物组合浓度、处理时间（2天）、Hoechst/PI染色条件、活细胞计数公式 阅读提示：Materials and Methods: Small molecule inhibition assays；Figure 2G-H |
| HDGF-LGR5复合物验证 | 药物处理组合（vemurafenib、dabrafenib、trametinib）、处理时间（72h）、抗体（抗LGR5和抗HDGF）用于Co-IP 阅读提示：Materials and Methods: Co-IP assays；Figure 5B-D |
| 球体形成实验 | 细胞密度、培养基成分（生长因子）、siRNA转染浓度、MAPKi浓度、观察时间（7天） 阅读提示：Materials and Methods: Spheroid formation assays；Figure 7 |