建立结直肠癌类器官模型
构建来源于患者肿瘤和细胞系的类器官，作为体外模型以评估化疗药物与热疗的协同作用。
收集22例患者结直肠癌手术标本和4种结直肠癌细胞系（SW620、SW480、DLD-1、COLO 205），消化分离细胞后包埋于生长因子减少型Matrigel中，通过微流控装置制备含细胞Matrigel微球（直径600 μm），打印至96孔板，培养7天（患者来源）或3天（细胞系来源）形成类器官。
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雷替曲塞作为在患者来源的结直肠癌类器官中筛选出的协同热化疗药物
Raltitrexed as a synergistic hyperthermia chemotherapy drug screened in patient-derived colorectal cancer organoids.
实验完整度
高包含患者来源类器官药物筛选和细胞系验证，结合RNA-seq转录组分析和Western blot机制验证，以及HIPEC患者临床结果对照。
主要模型
患者来源结直肠癌类器官（PDOs，22例） 结直肠癌细胞系来源类器官（SW620、SW480、DLD-1、COLO 205）
重点核对
患者类器官培养条件：生长因子减少型Matrigel包埋，微流控打印成微球，含特定培养基（20% FBS、100 ng/mL noggin等） 热疗处理条件：43°C孵育90分钟，随后37°C培养48小时 药物筛选浓度范围：7种药物浓度范围从0到1000 μM（具体见表2） HCSER计算：IC50（37°C）/IC50（43°C），IC50基于CCK-8活力检测 患者分组：22例患者分为高HCSER组（11例）和低HCSER组（11例），比较临床特征
摘要
目的：类器官最近被用作结直肠癌热化疗联合体外模型来筛选化疗药物。我们的研究旨在建立患者来源的结直肠癌类器官库，以评估化疗药物与热疗之间的协同作用；验证热化疗增敏增强比（HCSER）指标，以确定受热疗增强最显著的化疗药物；并为腹腔热灌注化疗推荐化疗药物。方法：类器官由结直肠癌患者样本或结直肠癌细胞系中提取的细胞培养而成。来自两种来源的细胞被包封在3D Matrigel液滴中，通过微流控和相转移形成相同的含细胞Matrigel微球。微球被接种在96孔板中，每个孔含有一个微球，7天后发育成类器官。类器官用于评估化疗药物在37°C对照和43°C 90分钟条件下的疗效，以检查热疗协同作用。使用10% CCK8计数细胞活力。结果：我们成功建立了来自22例患者原发肿瘤的结直肠癌类器官库。我们检测了7种常用的腹腔热灌注化疗药物的热疗协同作用。在22个患者类器官中的11个中，雷替曲塞具有显著的热疗协同作用，其HCSER评分在每个患者组内最高。结论：我们的研究主要证明了使用患者来源的结直肠癌类器官作为体外模型来评估热疗协同化疗药物。我们发现，在常见的抗结直肠癌药物中，热疗对雷替曲塞的增强作用最为显著。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用患者来源的结直肠癌类器官筛选与热疗协同的化疗药物，并识别出最受益于热疗的药物？
- 核心机制
- 热疗可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR和黏着斑激酶（focal adhesion kinase）信号通路增强雷替曲塞的疗效。
- 主要证据
- RNA-seq分析显示雷替曲塞敏感组与不敏感组之间有超过1200个差异表达基因，KEGG通路富集分析提示PI3K-AKT和黏附斑信号通路参与；Western blot显示高HCSER组中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、4E-BP1、p-4E-BP1、黏着斑激酶和p-黏着斑激酶的表达下调。
- 研究意义
- 患者来源类器官可作为个性化筛选HIPEC化疗药物的体外模型，有助于临床选择热疗协同化疗药物，改善HIPEC治疗效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估化疗药物与热疗的协同作用
通过比较药物在37°C和43°C条件下的IC50，计算HCSER，筛选出与热疗协同作用最强的化疗药物。
对类器官分别用7种化疗药物（奥沙利铂、洛铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、丝裂霉素、雷替曲塞、白蛋白紫杉醇）在37°C和43°C条件下处理90分钟，随后在37°C培养48小时，用CCK-8检测细胞活力，计算IC50和HCSER。
转录组分析机制
探索雷替曲塞热疗增敏的潜在分子机制。
对5例患者来源类器官（3例对雷替曲塞不敏感，2例敏感）进行RNA-seq分析，筛选差异表达基因（DEGs），进行KEGG通路富集分析，并进一步通过Western blot验证相关信号通路蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
类器官建模
药物敏感性评估
蛋白表达验证
临床数据分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| 杜氏改良Eagle培养基/F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞消化 | 胶原酶I | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养添加物 | Noggin蛋白 | MCE | -- |
| R-spondin 1蛋白 | MCE | -- | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | MCE | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HEPES缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| B-27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Y-27632 | Abmole | -- | |
| FibrOut | Chi Scientific | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | KenGEN BioTECH | -- |
| 化学发光成像系统 | Tanon 5200; Tanon Science & Technology Co. Ltd. | -- | |
| 细胞培养 | AQIX | -- | -- |
| 氟碳油（HFE-7000） | 3M Novec | -- | |
| 药物处理 | 雷替曲塞 | NANJING CHIA TAI TIANQING | -- |
| 丝裂霉素 | HANHUI PHARMA | -- | |
| 奥沙利铂 | SANOFI | -- | |
| 5-氟尿嘧啶 | PUDEP HARMA | -- | |
| 洛铂 | Hainan Changan International Pharmaceutical Co. Ltd. | -- | |
| 吉西他滨 | NANJING CHIA TAI TIANQING | -- | |
| 白蛋白紫杉醇 | CSPC | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官建立 | 患者肿瘤样本的消化条件（1.0 mg/mL胶原酶I，37°C，1-2小时）；细胞密度（2.0 × 10^7 cells/mL）；Matrigel浓度；培养时间（PDOs 7天，细胞系类器官3天）；培养基成分及添加剂浓度。 阅读提示：Materials and methods: Establishing colorectal cancer organoids |
| 药物处理与热疗 | 药物浓度梯度（见表2）；处理时间（90分钟）；热疗温度（43°C）；热疗后恢复时间（48小时）；CCK-8检测条件（10% CCK-8，孵育60分钟）。 阅读提示：Materials and methods: Drug screening by using colorectal cancer organoids; Hyperthermia treatment of organoids; Table 2 |
| HCSER计算 | IC50的计算方法（SPSS 26.0 Logit）；HCSER公式（IC50(37°C)/IC50(43°C)）；数据重复数（至少3个重复）。 阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis; Results: Raltitrexed has the highest HCSER |
| 转录组分析 | RNA-seq样本分组（敏感组P5、P10；不敏感组P15、P20、P22）；DEG筛选标准（log2FC>0.5或<-0.5，P≤0.05）；KEGG富集分析工具。 阅读提示：Results: Effects of raltitrexed on biological processes in colorectal cancer; Figure 3 |
| Western blot验证 | 蛋白提取组织来源（6例患者肿瘤组织）；分组（高HCSER组P13、P18、P21；低HCSER组P2、P3、P6）；上样量（30 μg）；一抗和二抗的浓度及孵育时间。 阅读提示：Materials and methods: Western blot; Results: Effects of raltitrexed on biological processes in colorectal cancer; Figure 3C |