生信分析筛选目标基因和通路
鉴定COPD相关的差异表达基因及富集通路，确定研究靶点。
利用GSE57148和GSE38974数据集，通过R语言limma包筛选DEGs，并进行KEGG通路富集分析，发现IL1B与TNF和IL-17信号通路相关。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
miR-937通过靶向IL1B并调控TNF-α/IL-17信号通路在香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞中发挥炎症抑制作用
miR-937 serves as an inflammatory inhibitor in cigarette smoke extract-induced human bronchial epithelial cells by targeting IL1B and regulating TNF-α/IL-17 signaling pathway.
实验完整度
中包含细胞模型（CSE诱导HBE细胞）、靶基因验证（双荧光素酶报告基因）、功能实验（CCK8、流式凋亡）及分子检测（RT-qPCR、Western blot、ELISA），但缺乏体内动物模型或患者样本验证。
主要模型
人支气管上皮细胞（HBE） CSE诱导的体外COPD细胞模型
重点核对
细胞系：HBE细胞，购自ATCC CSE浓度：20 μg/mL，处理时间：24小时 转染试剂：Lipofectamine 2000 关键分组：miR-937 mimic/inhibitor、NC、pcDNA3.1-IL1B、si-IL1B 检测指标：细胞活力（CCK8）、凋亡率、IL-6/IL-17/TNF-α表达
摘要
引言：本研究旨在阐明miR-937在香烟烟雾提取物（CSE）诱导的人支气管上皮（HBE）细胞中的生物学意义，并进一步探讨其可能的调控机制。方法：下载公共数据集以鉴定慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的差异表达基因，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。应用在线预测网站和荧光素酶报告基因实验确定miR-937与IL1B之间的靶向关系。使用RT-qPCR、Western blot和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估指定分子的表达。用CSE（20 μg/mL）处理HBE细胞构建体外COPD模型。通过细胞计数试剂盒8和Annexin-V/碘化丙啶（PI）染色实验检测细胞增殖和凋亡。结果：根据GSE57148数据，与健康对照相比，IL1B在COPD样本中上调，并与TNF和IL-17通路高度相关。此外，IL1B被预测为miR-937的靶标，并被miR-937负调控。CSE处理降低了miR-937的表达，同时降低了HBE细胞的增殖，增强了细胞凋亡，并升高了IL-6、IL-17和TNF-α的表达。此外，在CSE模型中，miR-937的上调促进了细胞活力，抑制了细胞凋亡，并降低了IL-6、IL-17和TNF-α的水平，而这些效应可被IL1B过表达所消除。相反，抑制miR-937阻碍了细胞增殖，促进了细胞凋亡，并升高了IL-6、IL-17和TNF-α的水平，而这些效应在CSE诱导的HBE细胞中可通过IL1B敲低而挽救。结论：这些发现表明miR-937在CSE损伤后的HBE细胞中发挥保护作用，其机制可能是通过靶向IL1B并抑制TNF-α/IL-17信号通路来实现的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- miR-937在CSE诱导的人支气管上皮细胞损伤中扮演何种角色，其调控机制是否涉及靶向IL1B及TNF-α/IL-17信号通路？
- 核心机制
- miR-937通过直接靶向IL1B的3'UTR负调控其表达，进而抑制TNF-α/IL-17信号通路，从而发挥抗炎和保护细胞的作用。
- 主要证据
- 在CSE诱导的HBE细胞中，miR-937 mimics促进增殖并抑制凋亡，同时降低IL-6、IL-17和TNF-α水平，而IL1B过表达可逆转这些效应；miR-937 inhibitor则产生相反效应，且可被IL1B敲低挽救。
- 研究意义
- miR-937可能成为改善COPD治疗方法的潜在靶点，为理解COPD发病机制提供参考信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证miR-937与IL1B的靶向关系
验证IL1B是否为miR-937的直接靶基因。
使用TargetScan预测，并通过双荧光素酶报告基因实验确认miR-937与IL1B 3'UTR的结合。
构建CSE诱导的COPD细胞模型
建立体外COPD模型，模拟香烟烟雾对支气管上皮细胞的损伤。
使用20 μg/mL CSE处理HBE细胞24小时，检测miR-937表达及细胞增殖、凋亡。
功能获得与缺失实验评估增殖和凋亡
评估miR-937对CSE诱导的HBE细胞增殖和凋亡的影响，并验证是否依赖IL1B。
转染miR-937 mimic/inhibitor、pcDNA3.1-IL1B、si-IL1B等，通过CCK8和流式细胞术检测细胞活力和凋亡。
检测炎症因子表达及信号通路变化
验证miR-937/IL1B是否调控TNF-α/IL-17信号通路。
通过Western blot和ELISA检测IL-6、IL-17、TNF-α的表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证靶基因关系
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | EZNA RNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- |
| Power SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白定量 | Bio-Rad蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| ECL检测试剂盒 | Millipore | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒8 | Beyotime | -- |
| 细胞凋亡 | FITC标记的Annexin V | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | pmir-GLO荧光素酶报告载体 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| ELISA | IL-6、IL-17、TNF-α ELISA试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与CSE处理 | 细胞系：HBE细胞（来源ATCC）；CSE浓度：20 μg/mL；处理时间：24小时；培养基：RPMI-1640（含10% FBS、1%青霉素/链霉素） 阅读提示：Methods: Cell growth condition and CSE exposure |
| 细胞转染 | 转染试剂：Lipofectamine 2000；转染效率检测时间：24小时后；转染浓度：70-80%细胞密度 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度：1×10^3细胞/孔（96孔板）；CCK8检测时间点：0、24、48、72小时；CCK8试剂加入量：10 μL/孔；检测波长：450 nm 阅读提示：Methods: Cell proliferation |
| 细胞凋亡检测 | 细胞浓度：1×10^6细胞/mL；Annexin V和PI用量：各5 μL；染色时间：5分钟（室温，避光）；流式细胞仪：FACS Calibur；凋亡率计算：Q2+Q4百分比 阅读提示：Methods: Cell apoptosis |
| RT-qPCR | RNA反转录量：1 μg；内参基因：GAPDH（mRNA）、U6（miRNA）；定量方法：2^-ΔΔCt 阅读提示：Methods: Total RNA isolation and RT-qPCR |