表达miR-23a-3p的骨髓间充质干细胞在急性肺损伤小鼠模型中的分化能力与治疗效果的改善

Improved Differentiation Ability and Therapeutic Effect of miR-23a-3p Expressing Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Mice Model with Acute Lung Injury.

作者信息Peng Zhang, Linghua Liu, Lei Yao, Xiaoxue Song

PMID33632989

期刊Int J Stem Cells

发布时间2021-05-30

DOI10.15283/ijsc20136

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实验完整度

高

该研究包含体外双荧光素酶报告基因验证miR-23b-3p靶向FGF2，以及体内LPS诱导的ALI小鼠模型，并进行了功能验证（分化、炎症）和机制验证（靶向关系）。实验设计包含多个证据层级，满足‘高’的判定标准。

主要模型

C57BL/6小鼠LPS诱导ALI模型骨髓间充质干细胞（BMSCs） 293T细胞（用于慢病毒包装）

重点核对

ALI模型建立：100 μg LPS经气管内注射 BMSCs植入：5×10^4细胞经气管内注射分组：Control、LPS、LPS+NC、LPS+M、LPS+I、NC+FGF2-NC、M+FGF2-NC、NC+FGF2、M+FGF2 检测指标：miR-23b-3p、SPC、Oct4、Nanog、Occludin、FGF2表达，LWW/BW比值，组织病理，炎症因子水平双荧光素酶报告基因验证miR-23b-3p与FGF2的靶向关系

摘要

背景与目的：骨髓间充质干细胞（BMSCs）的植入已被认为是减轻急性肺损伤（ALI）的有效疗法。本研究旨在发现microRNA（miRNA）介导的BMSCs治疗效果改善。方法与结果：用脂多糖（LPS）诱导小鼠ALI。将慢病毒介导表达miR-23b-3p或成纤维细胞生长因子2（FGF2）的BMSCs经气管内注射到ALI小鼠中。通过免疫印迹或定量逆转录聚合酶链反应分析肺组织中miR-23b-3p、FGF2、Occludin和表面活性蛋白C（SPC）的表达。通过苏木精-伊红染色观察肺组织的组织病理学变化。通过肺湿重/体重（LWW/BW）比值评估肺水肿。通过ELISA评估支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-4和IL-8的水平。LPS注射下调肺组织中miR-23b-3p、SPC和Occludin的表达，增加LWW/BW比值并加重组织病理学异常，同时上调BALF中的IL-1β、IL-6、IL-4和IL-8。上调的miR-23b-3p抵消了LPS诱导的作用，而下调的miR-23b-3p加剧了LPS诱导的作用。FGF2是miR-23b-3p的靶基因，被miR-23b-3p上调所下调。过表达FGF2下调miR-23b-3p、SPC和Occludin的表达，增加LWW/BW比值并加重组织病理学异常，同时上调IL-1β、IL-6、IL-4和IL-8，并抵消了miR-23b-3p上调对ALI小鼠的作用。结论：在BMSCs中过表达miR-23b-3p通过靶向FGF2增强了BMSC介导的对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用。

ALI模型建立与BMSCs制备

建立LPS诱导的ALI小鼠模型，并制备过表达或低表达miR-23b-3p及FGF2的BMSCs。

6-8周龄雄性C57BL/6小鼠经气管内注射100 μg LPS建立ALI模型；BMSCs购自Cyagen Biosciences，用慢病毒感染使其过表达或低表达miR-23b-3p或过表达FGF2。

miR-23b-3p靶基因验证

验证miR-23b-3p是否直接靶向FGF2。

使用TargetScan预测结合位点，构建FGF2野生型或突变型3'UTR的双荧光素酶报告载体，与miR-23b-3p mimic共转染BMSCs，检测荧光素酶活性。

体内功能评估

评估植入不同处理的BMSCs对ALI小鼠肺损伤、分化及炎症的影响。

将不同慢病毒感染的BMSCs经气管内注入ALI小鼠，检测肺组织中miR-23b-3p、SPC、Oct4、Nanog、Occludin、FGF2表达，计算LWW/BW比值，进行HE染色，并检测BALF中炎症因子水平。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	OriCell小鼠间充质干细胞生长培养基	Cyagen Biosciences	MUXMX-90011
DMEM培养基	ThermoFisher	A4192101
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F8687
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	V900929
谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
慢病毒包装	Lipofectamine 3000转染试剂	ThermoFisher	L3000015
动物实验	脂多糖	Sigma-Aldrich	L2630
双荧光素酶报告基因实验	双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1980
pmirGLO载体	Promega	E1330
qRT-PCR	Trizol试剂	ThermoFisher	15596026
PureLink miRNA分离试剂盒	ThermoFisher	K157001
SuperScript IV逆转录酶	ThermoFisher	18090010
PowerUp SYBR Green预混液	ThermoFisher	A25742
实时荧光定量PCR检测系统	Bio-Rad	CFX Connect
免疫印迹	RIPA裂解缓冲液	ThermoFisher	89900
BCA蛋白定量试剂盒	ThermoFisher	A53227
12% SDS-PAGE凝胶	Beyotime	P0053A
PVDF膜	Sigma-Aldrich	P2438
增强化学发光试剂盒	ThermoFisher	WP20005
成像系统	ThermoFisher	iBright CL1500, A44240
抗Occludin抗体	Sigma-Aldrich	SAB3500301
抗SPC抗体	Abcam	ab211326
抗FGF2抗体	Sigma-Aldrich	SAB2108135
抗GAPDH抗体	Abcam	ab181602
组织病理学	二甲苯	Sigma-Aldrich	95682
石蜡	Sigma-Aldrich	1496904
中性树胶	Macklin	N861409
ELISA	IL-1β、IL-6、IL-4、IL-8 ELISA试剂盒	Keygentec	KGEMC001b, KGEMC004, KGEMC003, KGEMC104
酶标仪	BioTek	ELx808

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

OriCell小鼠间充质干细胞生长培养基

Cyagen Biosciences

MUXMX-90011

DMEM培养基

ThermoFisher

A4192101

胎牛血清

Sigma-Aldrich

F8687

青霉素/链霉素

Sigma-Aldrich

V900929

谷氨酰胺

Sigma-Aldrich

G7513

慢病毒包装

Lipofectamine 3000转染试剂

ThermoFisher

L3000015

动物实验

脂多糖

Sigma-Aldrich

L2630

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因检测系统

Promega

E1980

pmirGLO载体

Promega

E1330

qRT-PCR

Trizol试剂

ThermoFisher

15596026

PureLink miRNA分离试剂盒

ThermoFisher

K157001

SuperScript IV逆转录酶

ThermoFisher

18090010

PowerUp SYBR Green预混液

ThermoFisher

A25742

实时荧光定量PCR检测系统

Bio-Rad

CFX Connect

免疫印迹

RIPA裂解缓冲液

ThermoFisher

89900

BCA蛋白定量试剂盒

ThermoFisher

A53227

12% SDS-PAGE凝胶

Beyotime

P0053A

PVDF膜

Sigma-Aldrich

P2438

增强化学发光试剂盒

ThermoFisher

WP20005

成像系统

ThermoFisher

iBright CL1500, A44240

抗Occludin抗体

Sigma-Aldrich

SAB3500301

抗SPC抗体

Abcam

ab211326

抗FGF2抗体

Sigma-Aldrich

SAB2108135

抗GAPDH抗体

Abcam

ab181602

组织病理学

二甲苯

Sigma-Aldrich

95682

石蜡

Sigma-Aldrich

1496904

中性树胶

Macklin

N861409

ELISA

IL-1β、IL-6、IL-4、IL-8 ELISA试剂盒

Keygentec

KGEMC001b, KGEMC004, KGEMC003, KGEMC104

酶标仪

BioTek

ELx808

环节	核对要点
细胞培养和慢病毒感染	BMSCs来源（C57BL/6小鼠，Cyagen Biosciences），培养基（OriCell小鼠间充质干细胞生长培养基），培养条件（37°C，5% CO2），感染方法（慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1或GV280，转染试剂Lipofectamine 3000），感染时MOI。阅读提示：详见Materials and Methods的Cell cultures、Lentiviral vector construction, packaging, and infection。
ALI模型的建立	小鼠品系（C57BL/6），性别（雄性），年龄（6-8周），体重（20-25g），LPS剂量（100 μg/只），给药方式（气管内注射），对照组（未处理或PBS）。阅读提示：详见Materials and Methods的Preparation of animals and establishment of ALI models。
BMSCs植入	细胞数（5×10^4），注射体积（30 μl PBS），注射方式（气管内注射），时间（建模后4小时），分组（Control、LPS、LPS+NC、LPS+M、LPS+I、NC+FGF2-NC、M+FGF2-NC、NC+FGF2、M+FGF2）。阅读提示：详见Materials and Methods的Animal grouping。
分子检测	qRT-PCR引物序列（Table 1），免疫印迹抗体（Occludin、SPC、FGF2、GAPDH）及稀释比例，组织来源（肺组织），样本量（每组小鼠数量6只）。阅读提示：详见Materials and Methods的Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)、Immunoblot。
炎症因子和肺水肿评估	BALF收集方法（气管插管灌洗3次），ELISA试剂盒（Keygentec）及货号，LWW/BW比值计算（肺湿重/体重），组织病理学染色（HE染色）。阅读提示：详见Materials and Methods的Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)、Evaluation of lung edema、Histopathology。

环节

核对要点

细胞培养和慢病毒感染

BMSCs来源（C57BL/6小鼠，Cyagen Biosciences），培养基（OriCell小鼠间充质干细胞生长培养基），培养条件（37°C，5% CO2），感染方法（慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1或GV280，转染试剂Lipofectamine 3000），感染时MOI。

阅读提示：详见Materials and Methods的Cell cultures、Lentiviral vector construction, packaging, and infection。

ALI模型的建立

小鼠品系（C57BL/6），性别（雄性），年龄（6-8周），体重（20-25g），LPS剂量（100 μg/只），给药方式（气管内注射），对照组（未处理或PBS）。

阅读提示：详见Materials and Methods的Preparation of animals and establishment of ALI models。

BMSCs植入

细胞数（5×10^4），注射体积（30 μl PBS），注射方式（气管内注射），时间（建模后4小时），分组（Control、LPS、LPS+NC、LPS+M、LPS+I、NC+FGF2-NC、M+FGF2-NC、NC+FGF2、M+FGF2）。

阅读提示：详见Materials and Methods的Animal grouping。

分子检测

qRT-PCR引物序列（Table 1），免疫印迹抗体（Occludin、SPC、FGF2、GAPDH）及稀释比例，组织来源（肺组织），样本量（每组小鼠数量6只）。

阅读提示：详见Materials and Methods的Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)、Immunoblot。

炎症因子和肺水肿评估

BALF收集方法（气管插管灌洗3次），ELISA试剂盒（Keygentec）及货号，LWW/BW比值计算（肺湿重/体重），组织病理学染色（HE染色）。

阅读提示：详见Materials and Methods的Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)、Evaluation of lung edema、Histopathology。

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