临床标本表达分析
检测肝内胆管癌组织中MT1JP和miR-18a-5p的表达水平及其与临床病理特征的关系。
收集12对肝内胆管癌和癌旁组织，用实时PCR检测MT1JP和miR-18a-5p表达；另收集30例肝内胆管癌样本分析MT1JP表达与临床特征的相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
长链非编码RNA MT1JP通过调控miR-18a-5p/FBP1轴在肝内胆管癌中发挥保护作用
LncRNA MT1JP plays a protective role in intrahepatic cholangiocarcinoma by regulating miR-18a-5p/FBP1 axis.
实验完整度
高包含临床标本表达分析、体外细胞功能实验、双荧光素酶机制验证及裸鼠异种移植实验，多重层次验证。
主要模型
肝内胆管癌临床标本及配对癌旁组织 肝内胆管癌细胞系HCCC-9810、RBE、HUCCT1 原代肝内胆管上皮细胞 裸鼠异种移植模型
重点核对
临床标本中MT1JP和miR-18a-5p的表达水平 MT1JP过表达质粒和siRNA的转染效果 CCK-8、流式细胞术、Transwell实验检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭 双荧光素酶报告基因验证MT1JP与miR-18a-5p、miR-18a-5p与FBP1 3'UTR的结合 裸鼠异种移植实验中肿瘤体积、HE、TUNEL和Ki-67染色
摘要
背景：胆管癌是消化系统常见的恶性肿瘤。长链非编码RNA金属硫蛋白1J假基因（MT1JP）已被报道在多种癌症中发挥肿瘤抑制作用。然而，其对胆管癌的作用尚未被评估。方法：通过实时PCR检测肝内胆管癌标本及配对癌旁组织中MT1JP的表达。将MT1JP过表达质粒和siRNA转染入肝内胆管癌细胞以改变MT1JP的表达水平。采用CCK-8、流式细胞术和Transwell实验检测增殖、细胞周期转换、凋亡、迁移和侵袭。采用双荧光素酶报告基因实验、实时PCR和Western blot筛选MT1JP结合的miRNA。此外，采用异种移植实验检测胆管癌细胞在裸鼠中的成瘤能力。结果：MT1JP在肝内胆管癌标本中下调，其表达与TNM分期和淋巴结转移相关。MT1JP过表达抑制肝内胆管癌细胞的增殖、细胞周期转换、迁移和侵袭，并诱导凋亡。MT1JP敲低导致相反的结果。MT1JP结合miR-18a-5p以促进果糖-1,6-二磷酸酶1（FBP1）的表达。miR-18a-5p在肝内胆管癌样本中升高，其表达与MT1JP负相关。此外，MT1JP还抑制裸鼠的肿瘤发生。结论：MT1JP通过调控miR-18a-5p/FBP1轴减轻胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导凋亡。这些发现可能为胆管癌的临床诊断和治疗提供新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MT1JP在肝内胆管癌中表达及其对肿瘤细胞生物学行为的影响和潜在分子机制。
- 核心机制
- MT1JP作为miR-18a-5p的海绵，竞争性结合miR-18a-5p，从而上调FBP1的表达，进而抑制肿瘤恶性行为。
- 主要证据
- 临床标本检测显示MT1JP下调、miR-18a-5p上调；细胞实验显示MT1JP过表达抑制增殖、迁移和侵袭并促进凋亡；双荧光素酶实验证实MT1JP与miR-18a-5p结合及miR-18a-5p与FBP1 3'UTR结合；裸鼠实验证实MT1JP抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 为胆管癌的诊断和治疗提供新的潜在靶点（文中提及novel diagnostic and therapeutic targets）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞功能实验
探究MT1JP对肝内胆管癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。
在HCCC-9810细胞中过表达MT1JP，在HUCCT1细胞中敲低MT1JP，通过CCK-8、流式细胞术、Transwell实验检测细胞功能变化。
分子机制验证
验证MT1JP与miR-18a-5p的直接结合以及miR-18a-5p对FBP1的靶向调控。
通过RNAhybrid预测结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证MT1JP与miR-18a-5p、miR-18a-5p与FBP1 3'UTR的结合；Western blot和免疫荧光检测FBP1表达变化。
回复实验
验证MT1JP的功能是否通过miR-18a-5p/FBP1轴介导。
在HCCC-9810细胞中共转染MT1JP过表达质粒与miR-18a-5p mimics或FBP1 siRNA，检测细胞活力、凋亡和侵袭能力的变化。
体内成瘤实验
评估MT1JP在体内对肝内胆管癌细胞成瘤能力的影响。
将稳定过表达MT1JP的HCCC-9810细胞皮下注射到裸鼠，观察肿瘤生长，并通过HE、TUNEL、免疫组化检测肿瘤组织病理变化及蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取和逆转录 | TRIpure试剂 | BioTeke | -- |
| M-MLV逆转录酶 | BioTeke | -- | |
| 实时PCR | 2×Power Taq PCR预混液 | BioTeke | -- |
| SYBR Green荧光染料 | Sigma | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂奶粉 | YILI | -- | |
| 抗PCNA抗体 | Abclonal | A0264 | |
| 抗caspase-3抗体 | Abclonal | A19654 | |
| 抗PARP抗体 | Abclonal | A0942 | |
| 抗细胞周期蛋白E抗体 | Affinity | AF0144 | |
| 抗细胞周期蛋白B1抗体 | Abclonal | A2056 | |
| 抗FBP1抗体 | Proteintech | 12842-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-47778 | |
| 山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Beyotime | A0216 | |
| ECL化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| 细胞培养 | 原代上皮细胞培养基 | iCell | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco BRL | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 稳定转染筛选 | G418抗生素 | -- | -- |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂 | KeyGEN | -- |
| 酶标仪 | BioTek | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC试剂 | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式细胞仪 | BD | -- | |
| PI/RNaseA缓冲液 | -- | -- | |
| Transwell实验 | 0.4%结晶紫 | Amresco | -- |
| Transwell小室 | Corning | -- | |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| 双荧光素酶实验 | pmirGLO载体 | -- | -- |
| 免疫荧光 | TritonX-100 | Beyotime | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 抗CK19抗体 | Abclonal | A0247 | |
| Cy3标记二抗 | Beyotime | A0516 | |
| DAPI染色液 | Aladdin | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Solarbio | -- | |
| HE染色 | 伊红 | Sangon | -- |
| TUNEL染色 | TUNEL缓冲液 | Roche | -- |
| Converter-POD试剂 | Roche | -- | |
| DAB底物 | Solarbio | -- | |
| 免疫组化 | 抗Ki-67抗体 | Affinity | AF0198 |
| HRP标记二抗 | Beyotime | -- | |
| 显微镜观察 | 显微镜（奥林巴斯XI53） | Olympus | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜（奥林巴斯BX53） | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床标本检测 | 标本类型（肝内胆管癌及配对癌旁组织）、数量（12对）、实时PCR检测MT1JP和miR-18a-5p表达 阅读提示：参见Methods中'Clinical specimens'部分 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系（HCCC-9810、RBE、HUCCT1）、培养基（RPMI-1640+10%FBS）、转染试剂（Lipofectamine 2000）、MT1JP过表达质粒和siRNA序列验证 阅读提示：参见Methods中'Cell culture'部分 |
| 细胞功能检测 | CCK-8实验的细胞密度、检测时间点（0、24、48、72h）；流式细胞术检测凋亡和细胞周期的染色方法；Transwell实验中细胞数（迁移3×10^3，侵袭1.5×10^4）和培养时间（24h） 阅读提示：参见Methods中'CCK-8 assay'、'Flow cytometry'、'Transwell assay'部分 |
| 分子机制验证 | 双荧光素酶报告基因实验中MT1JP和FBP1 3'UTR的野生型及突变型构建，miR-18a-5p mimics共转染 阅读提示：参见Methods中'Dual-luciferase assay'部分 |
| 体内成瘤实验 | 裸鼠品系（BALB/c）、细胞数（5×10^5）、每组数量（6只）、肿瘤测量间隔（每3天）、观察时间（3周） 阅读提示：参见Methods中'Xenograft model'部分 |