hsa_circ_0005379通过EGFR通路调节口腔鳞状细胞癌的恶性行为

Hsa_circ_0005379 regulates malignant behavior of oral squamous cell carcinoma through the EGFR pathway.

作者信息Wen Su, Yufan Wang, Feng Wang, Shuai Sun, Minghua Li, Yuehong Shen, Hongyu Yang
PMID31035951
发布时间2019-04-29
DOI10.1186/s12885-019-5593-5

实验完整度

研究包含体外细胞功能实验(CCK-8、Transwell、流式等)和体内异种移植模型,并涉及机制蛋白检测,但缺乏多层级独立验证。

主要模型

口腔鳞状细胞癌细胞系SCC25和CAL27 人脐静脉内皮细胞HUVEC BALB/c裸鼠异种移植瘤模型

重点核对

OSCC组织和细胞系中hsa_circ_0005379的表达水平(qRT-PCR) 过表达hsa_circ_0005379后细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的变化(CCK-8、EdU、Transwell、流式) hsa_circ_0005379对EGFR和p-EGFR表达的影响(Western blot) hsa_circ_0005379联合西妥昔单抗对凋亡的影响(流式) 体内异种移植模型中肿瘤生长和蛋白表达的变化

摘要

背景:口腔鳞状细胞癌(OSCC)是一种全球高发的口腔颌面部恶性肿瘤。越来越多的证据表明,环状RNA(circRNA)在调节肿瘤发展中起着重要作用。然而,circRNA在人类OSCC中的作用机制仍 largely 未知。方法:通过高通量转录组测序技术,我们对人类OSCC中的circRNA进行了 comprehensive 研究。通过qRT-PCR、Transwell实验、流式细胞术和western blot分析监测了circRNA hsa_circ_0005379对OSCC组织和细胞系的影响。使用异种移植小鼠模型评估肿瘤生长和动物存活。结果:我们发现,与配对的非癌性匹配组织相比,OSCC组织中circRNA hsa_circ_0005379的表达显著降低,并且与肿瘤大小和分化程度相关。hsa_circ_0005379的过表达在体外有效抑制OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖,并在体内抑制裸鼠中OSCC的生长。机制研究表明,hsa_circ_0005379可能参与表皮生长因子受体(EGFR)通路的调节。此外,我们发现hsa_circ_0005379的高表达可显著增强OSCC对西妥昔单抗药物的敏感性。结论:我们的研究结果提供了证据表明hsa_circ_0005379调节OSCC的恶性行为,并可能成为OSCC治疗的新治疗靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
环状RNA hsa_circ_0005379在口腔鳞状细胞癌中的表达及其对恶性行为的调控机制。
核心机制
hsa_circ_0005379通过影响EGFR表达来调节EGFR通路,从而调控OSCC的恶性行为。
主要证据
在OSCC组织和细胞系中检测到hsa_circ_0005379低表达;过表达抑制细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成,并抑制体内肿瘤生长;过表达降低EGFR和p-EGFR水平。
研究意义
hsa_circ_0005379可能成为OSCC治疗的新治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

检测hsa_circ_0005379在OSCC中的表达

明确hsa_circ_0005379在OSCC组织和细胞系中的表达水平及其临床相关性。

收集37对OSCC组织和癌旁正常组织,通过qRT-PCR检测hsa_circ_0005379表达;在OSCC细胞系(SCC9、SCC15、SCC25、CAL27)和正常口腔角质细胞(HOK)中检测表达水平。

2

过表达hsa_circ_0005379的体外功能实验

验证hsa_circ_0005379对OSCC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成的影响。

通过慢病毒感染在SCC25和CAL27细胞中稳定过表达hsa_circ_0005379,进行CCK-8、EdU掺入、Hoechst 33258染色、伤口愈合、Transwell迁移/侵袭、共培养和管形成实验。

3

敲降hsa_circ_0005379的体外功能验证

确认hsa_circ_0005379的下调对细胞功能和相关蛋白表达的影响。

使用siRNA在SCC25和CAL27细胞中敲降hsa_circ_0005379,检测相关蛋白(BAX、Bcl-2、MMP-9)表达变化,并观察功能表型。

4

验证hsa_circ_0005379对EGFR通路的调控

探究hsa_circ_0005379是否通过EGFR通路发挥作用,并确定其处于EGFR通路上游还是下游。

通过Western blot检测过表达或敲降hsa_circ_0005379后EGFR和p-EGFR的表达水平;使用EGFR激动剂NSC228155和抑制剂西妥昔单抗处理细胞,检测hsa_circ_0005379表达变化。

5

体内异种移植实验

评估hsa_circ_0005379过表达在体内对OSCC肿瘤生长的影响。

将稳定过表达hsa_circ_0005379或对照的CAL27细胞注射到4周龄BALB/c裸鼠皮下,监测肿瘤体积和重量,并进行H&E、Western blot和IHC染色。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco--
Lipofectamine 3000转染试剂Gibco--
嘌呤霉素Qcbio Science & Technologies Co. Ltd.--
RNeasy Mini试剂盒QIAGEN--
RNase REpicenter--
Prime Script RT Master MixTakara Bio Inc.--
PCR Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific--
CCK-8试剂盒Beyotime--
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒Beyotime Biotechnology Co. Ltd.--
Hoechst 33258染料Beyotime Biotechnology Co. Ltd.--
RIPA裂解液Beyotime Biotechnology--
Bcl-2抗体 (ab32124)Abcamab32124
BAX抗体 (ab32503)Abcamab32503
MMP-9抗体 (ab38898)Abcamab38898
Cyclin D1抗体 (ab134175)Abcamab134175
GAPDH抗体 (ab8245)Abcamab8245
Vimentin抗体 (5741T)CST5741T
E-cadherin抗体 (3195T)CST3195T
N-cadherin抗体 (13116T)CST13116T
β-catenin抗体 (8480T)CST8480T
EGFR抗体 (2085S)CST2085S
CD31抗体 (3528S)CST3528S
p-EGFR抗体 (3777S)CST3777S
山羊抗兔二抗 (A0208)Beyotime BiotechnologyA0208
山羊抗小鼠二抗 (A0216)Beyotime BiotechnologyA0216
Millipore化学发光液MilliporeSigma--
NSC228155----
西妥昔单抗----
Matrigel基质胶Corning Life Sciences--
FACSCalibur流式细胞仪BD Biosciences--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
临床样本表达检测
样本数量(37对),组织类型,hsa_circ_0005379表达水平与肿瘤大小和分化程度的相关性,ROC曲线分析。
阅读提示:Methods on Patients and tissue samples; Figure 1和Table 1
细胞培养和转染
细胞系来源(SCC25、CAL27等),培养条件(DMEM, 5% CO2, 37°C),siRNA序列,转染试剂(Lipofectamine 3000)。
阅读提示:Methods on Cell culture and transfection
功能实验
CCK-8细胞接种密度(2×10^3),EdU染色细节,伤口愈合时钟口时间和观察时间(0h,48h),Transwell迁移(24h)和侵袭(48h)时间,管形成时间(12h)。
阅读提示:Methods on CCK-8 assay, EdU incorporation assay, Wound-healing assay, Migration and invasion assays, Tube formation assay
药物处理
EGFR激动剂NSC228155浓度(29 μg/ml)和处理时间(15 min),西妥昔单抗浓度(10 μg/ml)和处理时间(72 h)。
阅读提示:Methods on CCK-8 assay section; Results on drug sensitivity
体内实验
细胞浓度(2×10^7 cells/100 μl),小鼠周龄(4周),测量周期(6周),肿瘤体积计算公式(V = πAB2/6)。
阅读提示:Methods on Tumorigenesis and staining