检测hsa_circ_0005379在OSCC中的表达
明确hsa_circ_0005379在OSCC组织和细胞系中的表达水平及其临床相关性。
收集37对OSCC组织和癌旁正常组织,通过qRT-PCR检测hsa_circ_0005379表达;在OSCC细胞系(SCC9、SCC15、SCC25、CAL27)和正常口腔角质细胞(HOK)中检测表达水平。
Hsa_circ_0005379 regulates malignant behavior of oral squamous cell carcinoma through the EGFR pathway.
研究包含体外细胞功能实验(CCK-8、Transwell、流式等)和体内异种移植模型,并涉及机制蛋白检测,但缺乏多层级独立验证。
口腔鳞状细胞癌细胞系SCC25和CAL27 人脐静脉内皮细胞HUVEC BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
OSCC组织和细胞系中hsa_circ_0005379的表达水平(qRT-PCR) 过表达hsa_circ_0005379后细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的变化(CCK-8、EdU、Transwell、流式) hsa_circ_0005379对EGFR和p-EGFR表达的影响(Western blot) hsa_circ_0005379联合西妥昔单抗对凋亡的影响(流式) 体内异种移植模型中肿瘤生长和蛋白表达的变化
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
明确hsa_circ_0005379在OSCC组织和细胞系中的表达水平及其临床相关性。
收集37对OSCC组织和癌旁正常组织,通过qRT-PCR检测hsa_circ_0005379表达;在OSCC细胞系(SCC9、SCC15、SCC25、CAL27)和正常口腔角质细胞(HOK)中检测表达水平。
验证hsa_circ_0005379对OSCC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成的影响。
通过慢病毒感染在SCC25和CAL27细胞中稳定过表达hsa_circ_0005379,进行CCK-8、EdU掺入、Hoechst 33258染色、伤口愈合、Transwell迁移/侵袭、共培养和管形成实验。
确认hsa_circ_0005379的下调对细胞功能和相关蛋白表达的影响。
使用siRNA在SCC25和CAL27细胞中敲降hsa_circ_0005379,检测相关蛋白(BAX、Bcl-2、MMP-9)表达变化,并观察功能表型。
探究hsa_circ_0005379是否通过EGFR通路发挥作用,并确定其处于EGFR通路上游还是下游。
通过Western blot检测过表达或敲降hsa_circ_0005379后EGFR和p-EGFR的表达水平;使用EGFR激动剂NSC228155和抑制剂西妥昔单抗处理细胞,检测hsa_circ_0005379表达变化。
评估hsa_circ_0005379过表达在体内对OSCC肿瘤生长的影响。
将稳定过表达hsa_circ_0005379或对照的CAL27细胞注射到4周龄BALB/c裸鼠皮下,监测肿瘤体积和重量,并进行H&E、Western blot和IHC染色。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Gibco | -- |
| 稳转筛选 | 嘌呤霉素 | Qcbio Science & Technologies Co. Ltd. | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RNA酶消化 | RNase R | Epicenter | -- |
| 逆转录 | Prime Script RT Master Mix | Takara Bio Inc. | -- |
| PCR | PCR Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology Co. Ltd. | -- |
| 核染色 | Hoechst 33258染料 | Beyotime Biotechnology Co. Ltd. | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Western blot - 一抗 | Bcl-2抗体 (ab32124) | Abcam | ab32124 |
| BAX抗体 (ab32503) | Abcam | ab32503 | |
| MMP-9抗体 (ab38898) | Abcam | ab38898 | |
| Cyclin D1抗体 (ab134175) | Abcam | ab134175 | |
| GAPDH抗体 (ab8245) | Abcam | ab8245 | |
| Vimentin抗体 (5741T) | CST | 5741T | |
| E-cadherin抗体 (3195T) | CST | 3195T | |
| N-cadherin抗体 (13116T) | CST | 13116T | |
| β-catenin抗体 (8480T) | CST | 8480T | |
| EGFR抗体 (2085S) | CST | 2085S | |
| CD31抗体 (3528S) | CST | 3528S | |
| p-EGFR抗体 (3777S) | CST | 3777S | |
| Western blot - 二抗 | 山羊抗兔二抗 (A0208) | Beyotime Biotechnology | A0208 |
| 山羊抗小鼠二抗 (A0216) | Beyotime Biotechnology | A0216 | |
| Western blot - 显影 | Millipore化学发光液 | MilliporeSigma | -- |
| 药物处理 | NSC228155 | -- | -- |
| 西妥昔单抗 | -- | -- | |
| 迁移侵袭实验 | Matrigel基质胶 | Corning Life Sciences | -- |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本表达检测 | 样本数量(37对),组织类型,hsa_circ_0005379表达水平与肿瘤大小和分化程度的相关性,ROC曲线分析。 阅读提示:Methods on Patients and tissue samples; Figure 1和Table 1 |
| 细胞培养和转染 | 细胞系来源(SCC25、CAL27等),培养条件(DMEM, 5% CO2, 37°C),siRNA序列,转染试剂(Lipofectamine 3000)。 阅读提示:Methods on Cell culture and transfection |
| 功能实验 | CCK-8细胞接种密度(2×10^3),EdU染色细节,伤口愈合时钟口时间和观察时间(0h,48h),Transwell迁移(24h)和侵袭(48h)时间,管形成时间(12h)。 阅读提示:Methods on CCK-8 assay, EdU incorporation assay, Wound-healing assay, Migration and invasion assays, Tube formation assay |
| 药物处理 | EGFR激动剂NSC228155浓度(29 μg/ml)和处理时间(15 min),西妥昔单抗浓度(10 μg/ml)和处理时间(72 h)。 阅读提示:Methods on CCK-8 assay section; Results on drug sensitivity |
| 体内实验 | 细胞浓度(2×10^7 cells/100 μl),小鼠周龄(4周),测量周期(6周),肿瘤体积计算公式(V = πAB2/6)。 阅读提示:Methods on Tumorigenesis and staining |