临床样本和动物模型中PVT1表达分析
评估PVT1表达与AAA的相关性。
通过qRT-PCR检测AAA患者腹主动脉组织和ApoE−/−小鼠Ang II诱导的AAA模型主动脉组织中PVT1的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
敲低lncRNA PVT1抑制小鼠腹主动脉瘤模型中的血管平滑肌细胞凋亡和细胞外基质破坏
Knockdown of lncRNA PVT1 Inhibits Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis and Extracellular Matrix Disruption in a Murine Abdominal Aortic Aneurysm Model.
实验完整度
高包含患者组织样本、细胞实验（过表达/敲低）和动物模型（ApoE−/−小鼠），并进行功能验证（凋亡、ECM、表型）和机制验证（MMP/TIMP）。
主要模型
小鼠原代血管平滑肌细胞 ApoE−/−小鼠Ang II诱导AAA模型 AAA患者腹主动脉组织
重点核对
PVT1敲低慢病毒注射（1×10^11 pfu/只，尾静脉） Ang II输注剂量（1000 ng/kg/min）及持续时间（28天） 细胞实验Ang II处理浓度（10 μM）和时间（48小时） 分组：NS、Ang II、Ang II+sh-Ctrl、Ang II+sh-PVT1 样本量：体内每组n=15，患者样本n=20
摘要
本研究旨在确定长链非编码RNA（lncRNA）浆细胞瘤变异易位1（PVT1）对小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型中血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡和细胞外基质（ECM）破坏的影响。在注射PVT1沉默慢病毒后，通过血管紧张素II（Ang II）输注四周在载脂蛋白E缺陷（ApoE−/−）雄性小鼠中诱导AAA。Ang II输注后，分析小鼠血清中促炎细胞因子水平，并分离主动脉组织进行组织学、RNA和蛋白质分析。我们的结果还表明，与对照组相比，AAA患者腹主动脉组织中PVT1表达显著上调。此外，Ang II处理在培养的小鼠VSMC和AAA小鼠腹主动脉组织中均显著增加PVT1表达。值得注意的是，Ang II促进细胞凋亡、增加基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9、减少MMP组织抑制剂（TIMP）-1以及促进培养的VSMC从收缩表型向合成表型转换的作用，通过过表达PVT1增强，但通过敲低PVT1减弱。此外，敲低PVT1逆转了Ang II诱导的小鼠AAA相关改变，表现为主动脉直径扩张减弱、明显的中膜增厚、主动脉弹性蛋白丢失、主动脉细胞凋亡增强、MMP-2和MMP-9升高、TIMP-1降低以及促炎细胞因子增加。总之，我们的研究结果表明，敲低lncRNA PVT1在Ang II诱导的小鼠AAA模型中抑制VSMC凋亡、ECM破坏和血清促炎细胞因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- lncRNA PVT1在腹主动脉瘤中对血管平滑肌细胞凋亡和细胞外基质破坏的作用及机制。
- 核心机制
- PVT1通过上调MMP-2和MMP-9、下调TIMP-1促进ECM降解，并促进VSMC从收缩表型向合成表型转换，进而导致VSMC凋亡和AAA形成。
- 主要证据
- AAA患者组织和Ang II诱导的AAA小鼠模型中PVT1表达上调；细胞实验显示PVT1过表达增强Ang II诱导的凋亡、ECM降解和表型转换，敲低则相反；体内实验显示敲低PVT1减弱主动脉扩张、弹性蛋白降解、细胞凋亡和炎症。
- 研究意义
- 抑制lncRNA PVT1可能成为预防AAA进展的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞实验中PVT1表达与功能验证
探究PVT1表达对Ang II诱导的VSMC凋亡、ECM降解和表型转换的影响。
在培养的小鼠原代VSMC中，通过过表达或敲低PVT1，并用Ang II处理，检测凋亡率、MMP-2/MMP-9/TIMP-1蛋白水平以及α-SMA/OPN表达。
体内敲低PVT1对Ang II诱导AAA的影响
验证体内敲低PVT1是否减轻Ang II诱导的AAA形成及相关病理改变。
ApoE−/−小鼠随机分为NS、Ang II、Ang II+sh-Ctrl、Ang II+sh-PVT1组。通过尾静脉注射慢病毒后，Ang II输注4周，超声测量主动脉直径，组织学分析（HE、EVG、TUNEL、免疫组化）以及血清炎症因子检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco BRL | -- |
| 胎牛血清 | Gibco BRL | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞培养转染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 动物模型 | 血管紧张素II | Sigma-Aldrich | -- |
| Alzet渗透压泵，型号2004 | Durect Corp | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 反转录 | 反转录系统试剂盒 | Takara | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green混合物 | Takara | -- |
| ABI StepOne-Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 流式细胞术 | FACScan流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液试剂盒 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 蛋白定量 | Bio-Rad蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗OPN抗体 | Abcam | ab8448 | |
| 抗MMP-2抗体 | Abcam | ab92536 | |
| 抗MMP-9抗体 | Abcam | ab38898 | |
| 抗TIMP-1抗体 | Abcam | ab38978 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Wuhan Boster Biotechnology | -- | |
| Kodak X-OMAT胶片 | Kodak | -- | |
| 组织学分析 | 抗MMP-2抗体（免疫组化） | Abcam | ab37150 |
| 抗MMP-9抗体（免疫组化） | Abcam | ab38898 | |
| 凋亡检测 | 细胞死亡原位检测试剂盒 | Roche Diagnostics | -- |
| 细胞因子检测 | TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒 | Bender MedSystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系：小鼠原代VSMC（Procell，cat. no. CP-M076）；培养基：DMEM+10% FBS；Ang II处理浓度10 μM，时间48小时；转染试剂polybrene 2 mg/mL；筛选浓度G418 600 mg/mL、嘌呤霉素1 mg/mL 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture, Generation of lncRNA-PVT1 overexpression and knockdown cells, Cell apoptosis assay |
| 动物模型构建 | 小鼠品系：ApoE−/−雄性，6-8周龄，20-25g；Ang II输注剂量1000 ng/kg/min，持续28天；渗透压泵Alzet Model 2004；慢病毒注射剂量1×10^11 pfu/只，尾静脉；分组：NS、Ang II、Ang II+sh-Ctrl、Ang II+sh-PVT1 阅读提示：Materials and Methods: Animals, AAA model and treatment |
| 体内检测指标 | 主动脉直径测量时间点：第0、7、14、21、28天；组织学染色（HE、EVG、TUNEL、免疫组化）；血清细胞因子检测（TNF-α、IL-1β、IL-6）；每组n=15 阅读提示：Materials and Methods: AAA model and treatment, Histological analysis, In situ detection of apoptotic cells, Cytokine measurement; Results: sh-PVT1 attenuates Ang II-induced AAA formation |