组织芯片免疫荧光筛选
检测RBD-SD1探针在33种正常人类组织中的结合情况，绘制潜在感染图谱。
对正常人类组织芯片进行免疫荧光染色，使用RBD-SD1蛋白探针（1:50稀释）4°C孵育72小时，并用His-Tag抗体和荧光二抗标记，DAPI染色后共聚焦显微镜观察，ImageJ统计RBD-SD1阳性细胞比例（n=3）。
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SARS-CoV-2刺突蛋白相互作用细胞在人类组织中的全景图
Landscape of SARS-CoV-2 spike protein-interacting cells in human tissues.
实验完整度
中包含免疫荧光组织芯片筛选、流式验证原代细胞结合、活病毒感染RT-qPCR检测等实验，但缺乏体内功能验证和机制深入验证，实验次数少（n=3或n=5）。
主要模型
正常人类组织芯片（33种组织） 人原代骨髓细胞 正常人类骨髓组织切片
重点核对
RBD-SD1蛋白探针（Novoprotein, Cat. DRA42, 1:50稀释） 正常人类组织芯片（Alenabio, cat. OC-Mul01092） 人原代骨髓细胞（Procell, Cat. CPH-185） SARS-CoV-2感染MOI：0、10^3、10^4，感染2小时，培养3天 RT-qPCR检测ACE2 mRNA表达
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）已成为全球大流行。然而，SARS-CoV-2的组织嗜性机制仍不清楚。在此，使用重组SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合亚结构域1（RBD-SD1）作为探针，研究SARS-CoV-2在三十三种正常人类组织中的潜在嗜性。观察到RBD-SD1探针与已报道的SARS-CoV-2感染器官中的细胞相互作用。有趣的是，RBD-SD1探针以血管紧张素转换酶2（ACE2）非依赖的方式与骨髓细胞强烈相互作用。此外，SARS-CoV-2诱导人原代骨髓细胞中ACE2 mRNA表达，提示人骨髓细胞可能对SARS-CoV-2感染敏感。因此，人骨髓细胞可能被SARS-CoV-2强烈感染，这可能在COVID-19的发病机制中起重要作用。这些发现提供了对SARS-CoV-2感染途径的更深入理解，从而有助于COVID-19的治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2在正常人类组织中的潜在感染途径是什么？
- 核心机制
- RBD-SD1探针与骨髓细胞以ACE2非依赖方式相互作用，可能通过CD209等替代受体介导；SARS-CoV-2感染可上调ACE2 mRNA表达，使骨髓细胞对感染敏感。
- 主要证据
- 免疫荧光显示RBD-SD1探针与33种组织中的细胞相互作用，其中骨髓细胞结合比例最高（约84%）；流式证实RBD-SD1探针结合63.4%的原代骨髓细胞；活病毒（MOI 10^3或10^4）感染后ACE2 mRNA显著升高。
- 研究意义
- 作者提出骨髓可能是SARS-CoV-2新的重要感染途径，该发现提供了感染图谱，可能有助于临床判断患者是否完全康复，并建议在骨髓移植前检测供者骨髓中是否存在SARS-CoV-2。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞类型共定位分析
探究RBD-SD1探针相互作用的细胞是否主要为上皮细胞（E-cadherin+）以及ACE2表达情况。
在组织芯片上对E-cadherin或ACE2进行免疫荧光共染，计算E-cadherin+或ACE2+细胞在RBD-SD1阳性细胞中的比例，并分析相关性（n=3或5）。
原代骨髓细胞流式验证
验证RBD-SD1探针对人原代骨髓细胞的结合能力。
将人原代骨髓细胞与RBD-SD1探针孵育，通过流式细胞术检测探针结合的细胞比例。
活病毒感染实验
直接验证SARS-CoV-2能否感染人原代骨髓细胞并影响ACE2表达。
在BSL-3实验室中，将人原代骨髓细胞以不同MOI（0、10^3、10^4）的SARS-CoV-2感染2小时，培养3天后收集细胞，通过RT-qPCR检测ACE2 mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织荧光 | RBD-SD1蛋白探针 | Novoprotein | DRA42 |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | 24E10 | |
| ACE2抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| 兔IgG | Beyotime Biotechnology | A7016 | |
| His标签抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| 羊抗鼠IgG Alexa Fluor 594偶联抗体 | Invitrogen | A-11005 | |
| 羊抗兔IgG Alexa Fluor 488偶联抗体 | Abcam | ab150077 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | Wetzlar, Germany | |
| 样本处理 | 柠檬酸钠抗原修复液 | Beyotime | P0081 |
| 免疫组织荧光 | Fc受体阻断剂 | BD Pharmingen™ | 564219 |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| RT-qPCR | Tripura试剂 | Roche Diagnostics | Indianapolis, IN |
| Oligo(dT)18引物 | -- | -- | |
| 样本来源 | 正常人类组织芯片 | Alenabio | OC-Mul01092 |
| 人原代骨髓细胞 | Procell Company | CPH-185 | |
| 福尔马林固定石蜡包埋的正常人类骨髓组织切片 | Fanpu Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织免疫荧光 | 组织芯片来源（Alenabio）、RBD-SD1探针浓度（1:50）、孵育时间（4°C 72小时）、抗原修复方式、抗体稀释度、n=3 阅读提示：Materials and methods 2.1-2.2；Figure legends 1 |
| 原代骨髓细胞结合实验 | 原代骨髓细胞来源（Procell）、RBD-SD1探针孵育条件、流式细胞术门控设置 阅读提示：Materials and methods 2.1；Results 3.4；Figure 4A-B |
| SARS-CoV-2感染实验 | 感染MOI（0/10^3/10^4）、感染时间（2小时）、培养时间（3天）、细胞数量（2×10^4/孔）、BSL-3实验室条件 阅读提示：Materials and methods 2.3；Figure 4C |
| RT-qPCR | RNA提取试剂（Tripura）、逆转录引物（oligo(dT)18）、PCR条件（94℃ 30s, 60℃ 1min, 72℃ 1min）、内参基因 阅读提示：Materials and methods 2.4 |