抗Scg3对角膜新生血管的抑制作用:初步研究

Inhibitory effect of anti-Scg3 on corneal neovascularization: a preliminary study.

作者信息He Jin, Binbin Yang, Dongdong Jiang, Zhixiang Ding, Yu Xiong, Xinsheng Zeng
PMID36443679
发布时间2022-11-28
DOI10.1186/s12886-022-02690-7

实验完整度

包含体外细胞实验(增殖、迁移、管形成)和体内兔碱烧伤模型,并进行了免疫荧光、qPCR和Western blot验证,但机制研究仅为初步,缺乏更深入的实验。

主要模型

人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 新西兰白兔碱烧伤角膜新生血管模型

重点核对

Scg3抗体浓度:0.1 µg/mL和0.5 µg/mL 给药方式:结膜下注射 给药频率:自碱烧伤日起每4天一次 观察时间:14天 检测标志物:CD31、LYVE1、CD45

摘要

背景:角膜新生血管(CNV)是一种导致失明的重要疾病。分泌粒蛋白III(Scg3)已成为新生血管的一个新的影响因素。本研究分析了Scg3抗体对CNV的抑制作用,并探讨了其初步机制。方法:用Scg3和抗Scg3处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。进行了细胞增殖、伤口愈合迁移和管形成实验。选择健康成年新西兰兔随机进行碱烧伤,建立角膜新生血管(CNV)模型。将兔随机分为3组(高浓度组、低浓度组和对照组)。给予兔不同剂量的抗Scg3和PBS。术后进行临床检查、免疫染色、实时定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹分析。结果:在体外研究中,Scg3抗体混合物抑制了Scg3诱导的内皮细胞增殖和血管生成。在体内研究中,对照组观察到明显的CNV。共聚焦显微镜也显示对照组有明显的活跃新生血管。高浓度组无明显CNV生长。此外,高浓度Scg3抗体处理后,CD31、LYVE1和CD45的表达显著抑制。qPCR和蛋白质印迹分析显示,在7天和14天,低浓度组和高浓度组的ERK水平高于对照组。对照组的VEGF水平显著高于高浓度组。在所有三组中,Akt水平在任何时间点均无显著差异。结论:Scg3的表达可影响体外HUVECs的生长。高浓度(0.5 µg/mL)Scg3抗体处理可减轻炎症反应,并抑制兔角膜碱烧伤后角膜新生血管的生长。MEK/ERK通路可能在抗Scg3的抑制作用中发挥重要作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
抗Scg3抗体是否能够抑制角膜新生血管的形成,并初步探索其可能的分子机制。
核心机制
抗Scg3抗体可能通过抑制炎症反应和影响MEK/ERK信号通路来抑制角膜新生血管。具体来说,Scg3可能激活MEK/ERK通路,而抗Scg3通过阻断该通路发挥作用,且不同于VEGF的Akt通路。
主要证据
体外实验显示抗Scg3抑制HUVECs增殖、迁移和管形成;体内实验显示高浓度(0.5 µg/mL)抗Scg3显著减少CNV,抑制CD31、LYVE1和CD45表达;qPCR和Western blot显示ERK水平升高,VEGF水平降低。
研究意义
作者提出研究为深入理解Scg3作用的分子机制提供帮助,并为未来开发新的抗Scg3治疗策略(通过阻断其下游细胞内信号级联)以及CNV的治疗或联合治疗提供新策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体外细胞实验

验证Scg3抗体对Scg3诱导的内皮细胞增殖、迁移和血管生成的影响

使用HUVECs,分别进行细胞增殖实验(CCK-8)、伤口愈合迁移实验和管形成实验。细胞分别用Scg3、Scg3+抗Scg3或PBS处理。

2

兔角膜碱烧伤模型建立

建立角膜新生血管动物模型,用于评估抗Scg3抗体的体内效果

选择健康成年新西兰白兔,戊巴比妥麻醉后,右眼用8mm圆形滤纸浸泡1mol/L NaOH溶液10秒,置于角膜中央40秒,然后用0.9%氯化钠溶液冲洗3分钟,并滴左氧氟沙星眼药水预防感染。

3

分组与给药

比较不同浓度抗Scg3抗体对CNV的影响

碱烧伤后将兔随机分为三组:低浓度组(0.1 µg/mL)、高浓度组(0.5 µg/mL)和对照组(PBS)。各组通过结膜下注射给予相应药物,每4天一次,共观察14天。

4

临床表现观察

评估角膜新生血管生长情况

使用裂隙灯显微镜和共聚焦显微镜观察各组兔角膜的新生血管情况。

5

免疫荧光染色

检测角膜组织中血管、淋巴管和白细胞浸润标志物的表达

取角膜组织,OCT包埋,切片6μm,进行免疫荧光染色。检测CD31(血管内皮标志物)、CD45(白细胞标志物)和LYVE1(淋巴管标志物)的表达。

6

qPCR检测

检测角膜组织中VEGF、ERK1/2和Akt的mRNA表达水平

提取角膜总RNA,逆转录为cDNA,使用qPCR检测基因表达。

7

Western blot检测

检测角膜组织中VEGF、ERK1/2和Akt的蛋白表达水平

提取角膜蛋白,SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,ECL显色,ImageJ定量。

8

统计分析

分析组间差异

使用SPSS 26.0进行单因素方差分析,组间比较采用LSD-t或Tamhane's T2检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
附着因子----
细胞计数试剂盒(CCK-8)Dojindo LaboratoriesCK04
基质胶Corning356234
OCT包埋剂SAKURA--
抗CD31抗体NOVUSNB100-64796SS
抗CD45抗体Gene TexGTX116018
抗LYVE1抗体Abcamab14917
TRIzol试剂Ambion, Invitrogen--
MonScript RTIII 全合一混合液Monad--
MonAmp™ Green qPCR MixMonad--
ABI 7500HT序列检测系统Thermo--
RIPA裂解液Beyotime--
抗VEGF抗体Abcam--
抗ERK1/2抗体Invitrogen--
抗Akt抗体Abnova--
抗GAPDH抗体Abcam--
羊抗鼠二抗Affinity Biosciences--
羊抗兔二抗Affinity Biosciences--
ECL试剂----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
体外细胞实验
HUVECs来源、Scg3和抗Scg3浓度、细胞接种密度、处理时间、Matrigel浓度
阅读提示:Methods 中的 In vitro study 部分
碱烧伤模型建立
NaOH浓度、滤纸直径、烧伤时间、冲洗时间
阅读提示:Methods 中的 Corneal angiogenesis assay 部分
分组与给药
抗Scg3浓度、给药途径、给药体积、给药频率、观察时间
阅读提示:Methods 中的 Corneal angiogenesis assay 部分
免疫荧光染色
一抗浓度和品牌、二抗孵育时间、切片厚度
阅读提示:Methods 中的 Immunofluorescence assay 部分
qPCR检测
引物序列、qPCR程序、内参基因、计算方法
阅读提示:Methods 中的 Quantitative real-time polymerase chain reaction 部分
Western blot检测
抗体浓度和品牌、蛋白上样量、转膜条件、封闭条件
阅读提示:Methods 中的 Western blotting 部分