生物信息学筛选
筛选与HCC免疫抑制相关的候选基因
从GEO获取HCC表达数据集，合并去批次效应，分析与PD-L1相关的基因，结合CTD和GeneCards数据库筛选候选基因，进行PPI分析，最终确定CD38为研究对象。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过CD38 siRNA负载的细胞外囊泡克服肝细胞癌对PD-1/PD-L1抑制剂的耐药性及其引起的免疫抑制
Overcoming the resistance of hepatocellular carcinoma to PD-1/PD-L1 inhibitor and the resultant immunosuppression by CD38 siRNA-loaded extracellular vesicles.
实验完整度
高研究包含临床样本、细胞系、小鼠模型等多层级证据，并进行了功能验证（siRNA敲低）和机制验证（腺苷通路及巨噬细胞极化）。
主要模型
人HCC细胞系HCCLM3 人单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞 小鼠HCC细胞系Hepa1-6异种移植瘤模型 人HCC组织及癌旁组织样本
重点核对
CD38在HCC组织和细胞系中的高表达 siCD38敲低效率及EVs/siCD38递送效率 EHNA抑制腺苷脱氨酶后腺苷积累量 小鼠模型中EVs/siCD38的给药剂量和频率 抗PD-L1抗体诱导的耐药模型的建立和验证
摘要
细胞外囊泡（EVs）是跨不同生物屏障递送药物的有前景的工具。在此，我们评估了EVs介导的CD38 siRNA递送对肝细胞癌（HCC）免疫抑制的潜力。从骨髓间充质干细胞培养基中分离EVs，并负载CD38 siRNA以制备EVs/siCD38。进行功能缺失实验以研究EVs/siCD38在HCC细胞中的生物学功能。进行异种移植小鼠模型以进一步验证。在HCC中发现CD38高表达。EVs/siCD38抑制CD38酶活性，减少腺苷产生，并促进巨噬细胞向M1型复极化，从而在体外抑制HCC细胞生长和转移，以及在小鼠中抑制肿瘤生长。机制上，在对PD-1/PD-L1抑制剂耐药的小鼠中CD38上调，EVs/siCD38在体内逆转了肿瘤对PD-1/PD-L1抑制剂的耐药性。我们的结果为使用EV介导的CD38 siRNA递送来预防HCC的免疫抑制特征提供了功能证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD38 siRNA负载的细胞外囊泡（EVs/siCD38）是否能通过逆转免疫抑制来克服肝细胞癌对PD-1/PD-L1抑制剂的耐药性？
- 核心机制
- CD38高表达通过腺苷受体通路促进巨噬细胞M2极化，导致免疫抑制和PD-1/PD-L1抑制剂耐药；EVs/siCD38通过抑制CD38酶活性、减少腺苷产生，促进巨噬细胞向M1极化，从而逆转免疫抑制和耐药性。
- 主要证据
- 临床样本和细胞系中CD38高表达；siCD38敲低降低CD38酶活性和腺苷产生，促进巨噬细胞M1极化并增强吞噬作用，抑制HCC细胞增殖和迁移；小鼠模型中EVs/siCD38抑制肿瘤生长，且在对PD-L1抑制剂耐药的小鼠中上调CD38，EVs/siCD38逆转耐药性。
- 研究意义
- 为使用EV介导的CD38 siRNA递送预防HCC免疫抑制提供了功能证据，并可能为克服PD-1/PD-L1抑制剂耐药提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床样本验证
验证CD38在HCC组织和细胞系中的表达
收集42例HCC患者的癌组织和癌旁组织，通过RT-qPCR和IHC检测CD38表达；同时检测人HCC细胞系（HCCLM3、Huh-7、MHCC97-L）和正常肝细胞MIHA中CD38的表达。
CD38敲低及功能实验
研究CD38敲低对HCC细胞功能及巨噬细胞极化的影响
在HCCLM3细胞中敲低CD38（siCD38），检测CD38酶活性、腺苷产量、巨噬细胞极化标志物、吞噬作用、细胞增殖、迁移和侵袭。
EVs/siCD38制备与表征
制备并表征负载CD38 siRNA的细胞外囊泡
从BM-MSC培养基中分离EVs，通过电穿孔负载siCD38，通过TEM、NTA、Western blot表征EVs形态、粒径和标志蛋白；验证HCCLM3细胞对EVs/siCD38的摄取及CD38表达敲低。
体内疗效评估
评估EVs/siCD38在小鼠中的抗肿瘤效果
将Hepa1-6细胞注射至C57BL/6小鼠腋下，1周后瘤周注射EVs或EVs/siCD38，测量肿瘤体积和重量，通过IHC、腺苷含量、流式细胞术分析肿瘤组织中的CD38、Ki67、巨噬细胞极化。
耐药模型建立与验证
构建PD-1/PD-L1抑制剂耐药模型并验证EVs/siCD38逆转耐药
对荷瘤小鼠长期注射抗PD-L1抗体建立耐药模型，检测耐药后肿瘤组织中CD38表达、腺苷含量和巨噬细胞极化；随后联合给予EVs/siCD38，评估对耐药肿瘤生长的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | PM150210 |
| DMEM培养基 | Procell | PM150210 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰酶/EDTA | -- | -- | |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 16096020 |
| cDNA逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR047A | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 04707516001 | |
| Western blot | PVDF膜 | Bio-Rad Laboratories | 1620177 |
| 抗CD38抗体 | Abcam | ab108403 | |
| 抗ARG1抗体 | Abcam | ab133543 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| ECL化学发光试剂 | Bio-Rad | 1705062 | |
| IHC | 正常山羊血清 | Beyotime | C0265 |
| 抗CD38抗体 | Abcam | ab216343 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| CD38酶活性检测 | 含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Sigma-Aldrich | NAD100-RO | |
| 腺苷检测 | EHNA | MCE | HY-103160A |
| 荧光腺苷检测试剂盒 | Abcam | ab211094 | |
| THP-1分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 |
| ELISA | IL-10 ELISA试剂盒 | Abbkine | KET6019 |
| IL-12 ELISA试剂盒 | Abbkine | KET6020 | |
| iNOS ELISA试剂盒 | Abcam | ab253217 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Abbkine | KET6032 | |
| 吞噬实验 | CFSE染料 | Sigma | 21888 |
| 超低吸附24孔板 | Corning | CLS3473-24EA | |
| CCK-8 | CCK-8溶液 | Dojindo | CK04 |
| Transwell | Transwell小室（8μm） | Corning | 3422 |
| 基质胶 | Corning | CLS354277 | |
| EVs分离 | 透射电子显微镜（H-7650） | Hitachi Chemical | -- |
| EVs表征 | NanoSight LM10纳米颗粒跟踪分析仪 | NanoSight Ltd. | -- |
| EVs/siCD38制备 | Gene Pulser X Cell电穿孔系统 | Bio-Rad | -- |
| EVs摄取 | Dil染料 | Beyotime | C1991S |
| DAPI染料 | Beyotime | C1005 | |
| 动物实验 | 抗PD-L1抗体 | ABclonal | A1645 |
| 对照IgG | ABclonal | A19711 | |
| 流式细胞术 | Hanks平衡盐溶液（含钙镁） | Procell | PB180323 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Liberase消化酶 | Roche | 5401054001 | |
| ACK裂解液 | Invitrogen | A1049201 | |
| 大鼠血清IgG | Sigma-Aldrich | I4131-10MG | |
| BV480-TCRβ抗体 | BD Bioscience | 746385 | |
| FITC-CD11b抗体 | BD Bioscience | 561688 | |
| PE-F4/80抗体 | BD Bioscience | 565410 | |
| Alexa Fluor® 647-CD206抗体 | BD Bioscience | 565250 | |
| APC-CD80抗体 | BD Bioscience | 560016 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本 | HCC组织与癌旁组织的配对关系、患者是否接受术前治疗、样本量（42例）、收集时间（2012-2016） 阅读提示：Materials and methods: Clinical tissue samples |
| 细胞培养 | 细胞系来源与培养条件（培养基、血清浓度、CO2浓度、温度）、传代条件（胰酶浓度） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| CD38敲低 | siRNA序列（Supplementary Table 2）、转染方法（慢病毒）、筛选浓度（4μg/mL嘌呤霉素处理14天，2μg/mL维持9天） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection; Supplementary Table 2 |
| 巨噬细胞极化实验 | THP-1分化条件（200nM PMA处理3天，恢复2天）、条件培养基收集时间（48小时）、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: THP-1 cell differentiation and Macrophage polarization assay |
| EVs制备 | EVs分离方法（差速离心）、电穿孔条件（400V, 125μF, 0.4cm杯, 30ms, 3次）、EVs与siRNA比例（20μg:20μg） 阅读提示：Materials and methods: Isolation and identification of EVs and Preparation of EVs/siCD38 |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、周龄（雌性C57BL/6，5-6周龄）、细胞接种数量、给药途径（瘤周注射）、剂量（100μg/只）、频率（隔天一次）、实验周期（24天） 阅读提示：Materials and methods: Xenograft tumor in mice |
| PD-1/PD-L1耐药模型 | 抗PD-L1抗体剂量（200μg）、给药方式（腹腔注射）、频率（隔天一次）、持续时间（8周）、EVs/siCD38给药方案（200μL PBS含100μg，瘤周，每周一次） 阅读提示：Materials and methods: Xenograft tumor in mice |
| 流式细胞术 | 组织消化条件（Liberase浓度、时间）、抗体克隆号、门控策略（FMO对照） 阅读提示：Materials and methods: Identification of murine macrophages by FACS |