褪黑素通过减少氧化应激、抑制细胞凋亡及维持血睾屏障完整性改善小鼠中敌草快诱导的睾丸毒性

Melatonin Ameliorates Diquat-Induced Testicular Toxicity via Reducing Oxidative Stress, Inhibiting Apoptosis, and Maintaining the Integrity of Blood-Testis Barrier in Mice.

作者信息Li Yang, Jianyong Cheng, Dejun Xu, Zelin Zhang, Rongmao Hua, Huali Chen, Jiaxin Duan, Xiaoya Li, Qingwang Li
PMID36851035
期刊Toxics
发布时间2023-02-08
DOI10.3390/toxics11020160

实验完整度

包含体内小鼠模型和体外GC1-spg细胞实验,并通过组织学、精子参数、激素检测、氧化应激指标、凋亡检测及蛋白表达分析等多层级验证。

主要模型

Kunming小鼠(体内模型) GC1-spg精原细胞系(体外模型)

重点核对

小鼠品系:Kunming小鼠,8周龄雄性 给药方式:腹腔注射,剂量:敌草快10 mg/kg b.w./day,褪黑素10 mg/kg b.w./day,连续28天 体外实验:GC1-spg细胞,敌草快浓度20、40、80、100 μM处理24小时 对照组设置:vehicle control(乙醇稀释液),褪黑素单独处理组 样本量:每组6只小鼠

摘要

敌草快是一种快速、强效且在农业中广泛使用的联吡啶类除草剂,它会在多种动物模型中诱导氧化应激。然而,其对雄性生殖系统的遗传毒性作用仍不清楚。褪黑素是一种有效的自由基清除剂,具有抗氧化和抗凋亡特性,并能保护睾丸免受氧化损伤。本研究旨在探讨褪黑素对小鼠中敌草快诱导的睾丸损伤的治疗作用。结果表明,褪黑素治疗减轻了敌草快诱导的睾丸损伤,包括抑制精子发生、增加精子畸形、降低睾酮水平和生育能力下降。具体来说,褪黑素治疗通过提高抗氧化酶GPX1和SOD1的产生来对抗敌草快诱导的氧化应激。褪黑素治疗还通过调节凋亡相关蛋白的表达,包括P53、Cleaved-Caspase3和Bax/Bcl2,在体内和体外减轻了敌草快诱导的精原细胞凋亡。此外,褪黑素通过促进支持细胞连接蛋白的表达和维持ZO-1的有序分布,恢复了血睾屏障。这些发现表明,褪黑素通过减少氧化应激、抑制细胞凋亡和维持血睾屏障的完整性来保护小鼠睾丸免受敌草快诱导的损伤。本研究为进一步保护男性生殖健康免受农业农药影响的研究提供了理论基础。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
褪黑素能否减轻敌草快诱导的小鼠睾丸损伤及其作用机制是什么?
核心机制
褪黑素通过减少氧化应激(增加GPX1和SOD1表达)、抑制细胞凋亡(下调P53、Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl2)以及维持血睾屏障完整性(恢复ZO-1、Occludin、β-catenin表达)来保护睾丸。
主要证据
体内小鼠模型显示褪黑素改善敌草快引起的睾丸重量下降、生精上皮变薄、精子计数减少和畸形增加、睾酮水平降低及生育力下降;体外GC1-spg细胞实验证实褪黑素抑制敌草快诱导的凋亡;Western blot和免疫荧光检测蛋白表达变化。
研究意义
研究为褪黑素作为预防或治疗敌草快暴露高风险人群男性不育症提供了理论基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体内动物模型建立与处理

评估敌草快对小鼠睾丸的毒性作用及褪黑素的保护效果

雄性Kunming小鼠随机分为对照组、敌草快组、褪黑素组和敌草快+褪黑素组,连续28天腹腔注射相应药物,记录一般状态,结束后分析睾丸和附睾质量、精子参数、组织学变化、激素水平等。

2

体外细胞实验

验证敌草快诱导精原细胞凋亡及褪黑素的保护作用

培养GC1-spg精原细胞,用不同浓度敌草快处理,检测细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达。

3

氧化应激水平检测

评估敌草快诱导的氧化应激及褪黑素的抗氧化作用

检测睾丸组织中ROS水平、MDA含量、SOD和GSH-Px活性,以及抗氧化蛋白GPX1和SOD1的表达。

4

细胞凋亡检测

评估敌草快诱导的睾丸细胞凋亡及褪黑素的抗凋亡作用

通过TUNEL染色检测睾丸组织细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白(P53、Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl2)表达变化。

5

血睾屏障完整性评估

评估敌草快对血睾屏障的破坏及褪黑素的保护作用

通过免疫荧光检测ZO-1的定位和表达,Western blot检测紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)、粘附连接蛋白(β-catenin)和间隙连接蛋白(Connexin43)的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
敌草快Sigma-Aldrich6385-62-2
褪黑素Sigma-Aldrich73-31-4
抗Sod1抗体WanleibioWL01846
抗Gpx1抗体WanleibioWL02497a
抗Bax抗体WanleibioWL01637
抗Bcl2抗体WanleibioWL01556
抗Cleaved Caspase3抗体WanleibioWL01992
抗P53抗体WanleibioWL01919
抗ZO-1抗体WanleibioWL03419
抗Occludin抗体WanleibioWL01996
抗β-catenin抗体WanleibioWL0962a
抗Connexin43抗体WanleibioWL02837
抗Tubulin抗体BeyotimeAF1216
睾酮ELISA试剂盒BeyotimePT872
DMEM培养基----
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒BeyotimeC1062M
RIPA裂解液BeyotimeP0013B
BCA蛋白测定试剂盒SolarbioPC0020
硝酸纤维素膜SolarbioYA1711
二抗ProteintechSA00001
ECL化学发光试剂MilliporeWBULS0100
ChemiDoc XRS凝胶成像系统Bio-Rad--
DCFH-DA探针BeyotimeS0033S
MDA检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute--
总SOD检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute--
GSH-PX检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute--
比色TUNEL凋亡检测试剂盒BeyotimeC1098
流式细胞仪Beckman--
酶标仪BioTek--
尼康光学显微镜Nikon--
尼康荧光显微镜Nikon--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物处理
动物品系(Kunming小鼠)、年龄(8周龄)、给药剂量(敌草快10 mg/kg/day,褪黑素10 mg/kg/day)、给药途径(腹腔注射)、处理时间(28天)、对照组设置。
阅读提示:见2.2 Animals and Animal Experiments
精子参数分析
精子采集部位(附睾尾)、精子计数方法、畸形率评估方法(Giemsa染色)。
阅读提示:见2.3 Assessment of Sperm Parameters
睾酮水平检测
血清样本处理、ELISA试剂盒操作步骤。
阅读提示:见2.5 Testosterone Assay
体外细胞实验
细胞系(GC1-spg)、培养条件(DMEM+10%FBS)、处理浓度(敌草快20,40,80,100 μM)和处理时间(24h)。
阅读提示:见2.6 Cell Culture and Treatment
氧化应激指标检测
ROS检测探针(DCFH-DA)、MDA/SOD/GSH-Px检测方法及试剂盒。
阅读提示:见2.10 Evaluation of ROS Levels
蛋白表达分析
蛋白提取方法(RIPA缓冲液)、抗体浓度、上样量(30μg)、封闭条件、曝光条件。
阅读提示:见2.8 Western Blotting
组织学分析
固定液(4%PFA)、切片厚度(5μm)、染色方法(H&E)及定量指标。
阅读提示:见2.4 Hematoxylin-Eosin (H&E) Staining