网络药理学预测
识别QRXY潜在靶点及UC相关差异基因，预测可能参与的通路。
使用SymMap数据库获取QRXY 10味中药的潜在靶点，GEO数据库获取UC相关芯片GSE53835，通过limma包分析差异表达基因，并对候选基因进行KEGG通路富集分析。
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清热泻痢方通过抑制TNFα/NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路和巨噬细胞M1极化发挥对溃疡性结肠炎发展的抑制作用
Qingre Xingyu recipe exerts inhibiting effects on ulcerative colitis development by inhibiting TNFα/NLRP3/Caspase-1/IL-1β pathway and macrophage M1 polarization.
实验完整度
高包含DSS诱导UC小鼠模型和Caco-2细胞模型，功能验证（TNFα过表达、NLRP3敲除）和机制验证（通路蛋白表达及巨噬细胞极化）相对完整。
主要模型
DSS诱导的C57BL/6小鼠UC模型 DSS处理的Caco-2细胞 NLRP3基因敲除Caco-2细胞
重点核对
DSS浓度3%（w/v）饮用7天诱导UC QRXY灌胃剂量每日1.62 g生药/kg TNFα过表达使用AAV2-TNFα (5×10^10 μg) 直肠灌注 Caco-2细胞DSS浓度2%（w/v）处理24小时 TNFα处理浓度10 ng/mL处理24小时
摘要
作为一种慢性炎症性肠病，溃疡性结肠炎（UC）因其不断增加的发病率给全球公共卫生带来了沉重负担。中药被认为是治疗UC的有效药物，且副作用较小。在本研究中，我们试图确定传统药物清热泻痢方（QRXY）在UC发展中的新作用，并通过探索QRXY方在UC中的下游机制，为目前UC的相关知识做出贡献。通过注射葡聚糖硫酸钠（DSS）建立UC小鼠模型，测定肿瘤坏死因子-α（TNFα）、NLR家族含吡啶结构域3（NLRP3）和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达，并分析它们的相互作用。成功构建了DSS处理的NLRP3基因敲除（−/−）Caco-2细胞模型。通过测定疾病活动指数（DAI）、组织病理学评分、跨上皮电阻、FITC-葡聚糖以及细胞增殖和凋亡，研究了QRXY方对UC的体内和体外效应。体内和体外实验表明，QRXY方通过抑制TNFα/NLRP3/caspase-1/IL-1β通路和巨噬细胞M1极化，减轻了UC小鼠肠黏膜损伤程度和DSS诱导的Caco-2细胞功能损伤，且TNFα过表达或NLRP3敲低可抵消QRXY方的治疗效果。总之，我们的研究表明，QRXY抑制TNFα的表达并使NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路失活，从而减轻肠黏膜损伤并缓解小鼠UC。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 清热泻痢方（QRXY）是否通过调控TNFα/NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路和巨噬细胞M1极化来缓解溃疡性结肠炎（UC）
- 核心机制
- QRXY通过抑制TNFα表达，进而抑制NLRP3表达，导致Caspase-1活化减少，最终降低IL-1β的产生，同时抑制巨噬细胞M1极化。
- 主要证据
- 在DSS诱导的UC小鼠和Caco-2细胞中，QRXY治疗抑制了TNFα/NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路相关蛋白表达，减少了肠道损伤和细胞功能损伤；TNFα过表达或NLRP3敲低可逆转QRXY的效果。
- 研究意义
- 该研究揭示了QRXY治疗UC的潜在分子机制，为开发新药和临床应用提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证QRXY对UC小鼠的治疗效果
验证QRXY是否能缓解DSS诱导的UC小鼠症状及肠道损伤。
C57BL/6小鼠自由饮用3% DSS 7天诱导UC，QRXY组灌胃QRXY（1.62 g/kg/日），同时部分小鼠直肠灌注AAV-TNFα或AAV-Control。评估体重、DAI、结肠长度、组织病理、ELISA、TUNEL、免疫荧光、RT-qPCR等。
体外验证QRXY对Caco-2细胞损伤的作用
验证QRXY是否减轻DSS诱导的Caco-2细胞功能障碍，并探究TNFα的作用。
Caco-2细胞用DSS诱导损伤，并给予QRXY和/或TNFα处理，检测Western blot、CCK-8、LDH、流式凋亡、ELISA、FITC-葡聚糖通透性、TEER及RT-qPCR。
NLRP3敲除验证机制
验证NLRP3在QRXY治疗中是否必要。
通过CRISPR/Cas9构建NLRP3敲除Caco-2细胞，用DSS诱导后给予QRXY和/或TNFα处理，检测相关指标。
巨噬细胞极化分析
验证QRXY是否抑制M1巨噬细胞极化。
通过免疫组化和免疫荧光检测结肠组织中iNOS和Arg1表达，通过RT-qPCR检测M1/M2标志物，通过流式细胞术检测腹膜细胞和固有层细胞中F4/80+CD16/32+细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DSS诱导UC模型 | 葡聚糖硫酸钠 | Yeasen | 60316ES60 |
| HE染色 | 中性缓冲福尔马林 | Solarbio | G2161 |
| 免疫组化 | 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab214185 |
| 抗Arg1抗体 | Abcam | ab233548 | |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab115819 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab205718 | |
| DAB显色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 免疫荧光 | 抗F4/80抗体 | Abcam | ab6640 |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab178945 | |
| 抗Claudin-1抗体 | Abcam | ab242370 | |
| 抗Occludin抗体 | Abcam | ab216327 | |
| 抗ZO-1抗体 | Abcam | ab221547 | |
| Alexa Fluor 488/594标记二抗 | Thermo Fisher | A32766/A-21203/A-21206/A32754 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 分离固有层细胞 | 胶原酶D | Roche | -- |
| 脱氧核糖核酸酶 | Roche | -- | |
| TUNEL染色 | TUNEL试剂盒 | Roche | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| Caco-2细胞系 | Procell | CL-0050 | |
| Transwell培养板 | Corning | 3413 | |
| 细胞处理 | TNFα重组蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂盒 | GLPBIO | GK10001 |
| LDH检测 | LDH检测试剂盒 | Beyotime | C0016 |
| TEER测量 | 细胞电阻仪 | Merck Millipore | MERS00002 |
| FITC-葡聚糖渗透实验 | FITC-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| Hank平衡盐溶液 | -- | -- | |
| 荧光测量 | 多功能酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | Multiskan |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC | Beyotime | -- |
| 碘化丙啶 | Beyotime | -- | |
| FITC标记大鼠抗小鼠F4/80 | BD Bioscience | -- | |
| PE标记抗小鼠CD16/32 | BD Bioscience | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂盒 | Invitrogen | 16096020 |
| 逆转录试剂盒 | Takara | RR047A | |
| 实时荧光定量PCR仪 | ABI | 7500 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA试剂盒 | Yeasen | 20201ES76 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH85R | |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab214185 | |
| 抗裂解Caspase-1抗体 | CST | 4199 | |
| 抗IL-1β抗体 | CST | 12242 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | ab8226 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab100713 |
| 小鼠IL-8 ELISA试剂盒 | LiankeBio | ml063162 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab197742 | |
| 小鼠TNFα ELISA试剂盒 | Abcam | ab208348 | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab178013 | |
| 人IL-8 ELISA试剂盒 | Abcam | ab214030 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠UC模型 | DSS浓度3% (w/v)，自由饮用7天；QRXY剂量1.62 g/kg/日；AAV-TNFα剂量5×10^10 μg溶于100μL PBS 阅读提示：Materials and methods 中的 'Mice model with UC induced by DSS' |
| Caco-2细胞实验 | DSS浓度2%（w/v）处理24小时；TNFα浓度10 ng/mL处理24小时；QRXY浓度10 μg/mL；细胞密度5×10^4 cells/insert 阅读提示：Materials and methods 中的 'Cell treatment' 和 'Construction of NLRP3 knockout cell model' |
| TNFα过表达 | AAV-TNFα使用直肠灌注，剂量5×10^10 μg，在DSS诱导前2周给予 阅读提示：Materials and methods 中的 'Mice model with UC induced by DSS' |
| NLRP3敲除 | NLRP3 sgRNA序列5’-CGAAGCAGCACTCATGCGAG-3’；CRISPR/Cas9构建 阅读提示：Materials and methods 中的 'Construction of NLRP3 knockout cell model' |
| 统计分析 | 多组比较采用one-way ANOVA和Tukey post hoc test；时间相关采用repeated measures ANOVA；显著性水平p<0.05 阅读提示：Materials and methods 中的 'Statistical analysis' |