生物信息学筛选
鉴定与ESCC组织学分级和TNM分期相关的lncRNA，并预测具有肽编码潜力的lncRNA。
基于TCGA ESCC RNA-seq数据，使用WGCNA分析鉴定与临床特征相关的模块；结合核糖体足迹数据（SRR1758391和SRR8550319）和ORF预测，筛选候选lncRNA；通过质谱数据集IPX0002962000鉴定肽段。
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食管鳞状细胞癌中鉴定出具有肽编码潜力的长链非编码RNA：KDM4A-AS1编码肽削弱癌细胞活力和迁移能力
Long noncoding RNAs with peptide-encoding potential identified in esophageal squamous cell carcinoma: KDM4A-AS1-encoded peptide weakens cancer cell viability and migratory capacity.
实验完整度
高包含生物信息学预测、体外细胞实验、分子机制研究和TRAP验证，证据层级较多且包含功能验证与机制验证。
主要模型
KYSE150细胞系 TE-1细胞系 HEK293T细胞系 TCGA ESCC临床样本
重点核对
细胞系：KYSE150、TE-1和HEK293T，通过STR鉴定且无支原体污染 转染试剂：Lipofectamine 3000，每孔5μL，质粒2.5μg，Opti-MEM稀释 CCK-8实验：细胞密度1×10^4/孔，转染后48小时检测 划痕实验：细胞融合至100%后划痕，0和48小时拍照 Transwell迁移：5×10^4细胞/孔，8μm孔径，48小时孵育
摘要
目前，关于长链非编码RNA（lncRNA）编码肽在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的知识相当缺乏。在本研究中，我们通过结合ESCC临床样本的加权基因共表达网络分析（WGCNA）、核糖体足迹、ORF预测、质谱（MS）鉴定和蛋白质印迹分析，同时鉴定了六个具有肽编码能力的lncRNA开放阅读框（ORF），包括赖氨酸特异性脱甲基酶4A反义RNA 1（KDM4A-AS1）ORF。KDM4A-AS1 ORF编码的肽降低了ESCC细胞活力和迁移能力。免疫共沉淀和MS分析显示，KDM4A-AS1编码的肽与ESCC细胞中的103种蛋白质特异性结合，富集分析表明肽结合蛋白与脂肪酸代谢和氧化还原过程相关。细胞和分子实验表明，KDM4A-AS1编码的肽抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶和脂肪酸合酶的表达，增加活性氧水平，并降低ESCC细胞中的线粒体膜电位。总之，通过多种方法结合，在ESCC中同时鉴定了多个具有翻译潜力的lncRNA，为lncRNA编码肽提供了新的鉴定策略。此外，lncRNA KDM4A-AS1编码的肽削弱了ESCC细胞活力和迁移能力，并在脂肪酸代谢和氧化还原过程中发挥作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 食管鳞状细胞癌中是否存在具有肽编码潜力的长链非编码RNA，以及这些编码肽对癌细胞功能的影响和分子机制是什么？
- 核心机制
- KDM4A-AS1编码肽通过抑制脂肪酸代谢相关基因SCD和FASN的表达，增加活性氧水平并降低线粒体膜电位，从而削弱ESCC细胞活力和迁移能力。
- 主要证据
- 通过WGCNA、核糖体足迹、ORF预测、质谱鉴定和蛋白质印迹验证了6个lncRNA编码肽；功能实验（CCK-8、划痕、Transwell）证明KDM4A-AS1编码肽抑制细胞活力和迁移；Co-IP和MS发现103个结合蛋白，富集分析显示与脂肪酸代谢和氧化还原相关；RT-qPCR和IF验证SCD和FASN下调，ROS升高和MMP降低。
- 研究意义
- 该研究首次通过多方法结合同时鉴定和验证了一批具有肽编码潜力的lncRNA，为ESCC中lncRNA编码肽的鉴定提供了新策略，并可能为ESCC的临床管理提供潜在的功能肽。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
编码能力验证
验证候选lncRNA ORF是否确实能够翻译产生小肽。
将12个ORF克隆到pcDNA3.1载体并融合flag标签，转染TE-1细胞后通过蛋白质印迹检测flag蛋白表达。
功能验证
评估KDM4A-AS1编码肽对ESCC细胞活力和迁移能力的影响。
在KYSE150和TE-1细胞中过表达Pep-KDM4A-AS1，通过CCK-8检测细胞活力，划痕实验和Transwell实验检测迁移能力。另设阴性对照pcDNA3.1和阳性对照Pep-LINC01116。
机制探索
鉴定KDM4A-AS1编码肽的结合蛋白及其富集的通路，并验证对脂肪酸代谢和氧化还原的影响。
通过Co-IP和MS分析鉴定与Pep-KDM4A-AS1结合的蛋白质，并进行GO和KEGG富集；在KYSE150和TE-1细胞中过表达Pep-KDM4A-AS1后，通过RT-qPCR检测SCD、FASN和ACOX1的mRNA水平，通过IF检测FASN蛋白，通过ROS检测试剂盒和JC-1染色检测ROS和MMP。
翻译验证
进一步验证KDM4A-AS1的翻译能力，包括IRES元件和核糖体结合。
利用TransLnc数据库确认IRES和核糖体占用；通过TRAP实验检测KDM4A-AS1与核糖体蛋白RPL10A的结合；将KDM4A-AS1 ORF的起始密码子ATG突变为ATT，验证翻译依赖性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
生物信息学分析
翻译验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | PM150110 |
| DMEM培养基 | Procell | PM150210 | |
| 胎牛血清 | Procell | 164210-50 | |
| 青霉素/链霉素 | Procell | PB180120 | |
| 基因分型 | PureLink基因组DNA小提试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| PowerPlex 21系统 | Promega | -- | |
| ABI 3730XL基因分析仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 支原体检测 | 支原体PCR检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Thermo Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Scientific | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1载体 | -- | -- |
| pLKO.1-CMC-copGFP-puro载体 | Qingke | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime Biotechnology | P1010 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012S | |
| PVDF膜 | Servicebio | G6045-0.22 | |
| 抗flag抗体 | DAIAN Biotechnology | 3064 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | DAIAN Biotechnology | Q1002 | |
| 超敏ECL化学发光试剂盒 | Servicebio | G2020-25mL | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime Biotechnology | C0037 |
| 迁移实验 | Transwell板（8μm孔径） | Costar Corning | -- |
| 结晶紫溶液 | Servicebio | -- | |
| TRAP实验 | 蛋白A/G磁珠 | DAIAN Biotechnology | M0134 |
| IgG抗体 | DAIAN Biotechnology | Q6004 | |
| GFP抗体 | DAIAN Biotechnology | 2057 | |
| RNA提取 | RNAeasy动物RNA提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | R0024 |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG快速免疫共沉淀试剂盒 | DAIAN Biotechnology | KIP0064 |
| 银染 | 快速银染试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0017S |
| 质谱分析 | RIGOL L-3000高效液相色谱系统 | RIGOL TECHNOLOGIES | -- |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| FAIMS Pro接口 | Thermo Scientific | -- | |
| Nanospray Flex离子源 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | TRI试剂 | Thermo Scientific | AM9738 |
| 逆转录 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | K1621 |
| RT-qPCR | SYBR Select预混液 | Thermo Scientific | 4472919 |
| 免疫荧光 | 抗FASN抗体 | Proteintech | 10624-2-AP |
| FITC标记的山羊抗小鼠二抗 | Servicebio | GB22301 | |
| DAPI | Servicebio | -- | |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0033S |
| MMP检测 | 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） | Beyotime Biotechnology | C2006 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、抗生素浓度、培养条件（5% CO2，37°C） 阅读提示：Materials and methods 2.2节 |
| 转染 | 转染试剂、用量、质粒量、opti-MEM体积、孵育时间 阅读提示：Materials and methods 2.2节 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度、转染后检测时间、CCK-8孵育时间、波长 阅读提示：Materials and methods 2.7节 |
| 迁移实验 | 划痕实验细胞融合度、拍照时间、Transwell细胞数、孔径、孵育时间 阅读提示：Materials and methods 2.8和2.9节 |
| 蛋白质印迹 | 蛋白上样量、SDS-PAGE浓度、抗体稀释比例、孵育时间、ECL化学发光 阅读提示：Materials and methods 2.6节 |
| RT-qPCR | RNA提取试剂、cDNA合成试剂、定量PCR试剂、引物序列、内参基因、相对定量方法 阅读提示：Materials and methods 2.17节 |
| 机制实验 | Co-IP试剂、抗体、银染；MS参数；ROS检测试剂盒；JC-1染色方法 阅读提示：Materials and methods 2.13、2.14、2.19、2.20节 |