筛选KK-LC-1作为ALDH+细胞相关候选基因
寻找在三阴性乳腺癌中与化疗耐药和肿瘤干细胞相关的潜在靶点。
对多西他赛耐药的MDA-MB-231细胞进行mRNA测序，与亲本细胞比较，筛选上调基因并与TNBC组织上调基因取交集，随后在PDX模型的ALDH+和ALDH-细胞中验证候选基因表达。
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KK-LC-1作为消除三阴性乳腺癌ALDH+干细胞的治疗靶点
KK-LC-1 as a therapeutic target to eliminate ALDH+ stem cells in triple negative breast cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验、类器官成球实验、移植瘤模型、PDX模型及临床样本分析，并通过功能验证（敲除/过表达/药物处理）和机制验证（免疫共沉淀、泛素化、Hippo通路蛋白检测）
主要模型
三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468 ALDH+细胞亚群 细胞系来源的裸鼠移植瘤模型 患者来源的PDX模型
重点核对
TNBC PDX模型中ALDH+细胞的分离和KK-LC-1表达检测 CRISPR-Cas9介导的KK-LC-1敲除对ALDH+细胞比例和自我更新的影响 KK-LC-1与FAT1的相互作用及其对FAT1泛素化和降解的调控 小分子化合物Z8对KK-LC-1/FAT1结合的破坏及其对Hippo通路和ALDH+细胞的影响 体内实验中Z8的给药剂量和肿瘤生长抑制效果
摘要
辅助治疗后未能完全消除三阴性乳腺癌（TNBC）干细胞与不良预后相关。乙醛脱氢酶1（ALDH1）是乳腺癌干细胞（BCSCs）的标志物，其酶活性调节肿瘤干性。识别控制ALDH+细胞的上游靶点可能有助于抑制TNBC肿瘤。在这里，我们显示KK-LC-1通过结合FAT1并随后促进其泛素化和降解来决定TNBC ALDH+细胞的干性。这会损害Hippo通路并导致YAP1核转位和ALDH1A1转录。这些发现确定了TNBC ALDH+细胞中的KK-LC-1-FAT1-Hippo-ALDH1A1通路作为治疗靶点。为了逆转由KK-LC-1表达引起的恶性肿瘤，我们采用计算方法并发现Z839878730（Z8）作为可能破坏KK-LC-1和FAT1结合的小分子抑制剂。我们证明Z8通过重新激活Hippo通路并降低TNBC ALDH+细胞的干性和活力来抑制TNBC肿瘤生长。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KK-LC-1是否通过调控ALDH+乳腺癌干细胞的干性影响三阴性乳腺癌的进展，以及能否靶向该通路进行治疗？
- 核心机制
- KK-LC-1通过结合FAT1并促进其泛素化和降解，损害Hippo通路，导致YAP1核转位和ALDH1A1转录，从而维持ALDH+细胞的干性。
- 主要证据
- 在细胞系、PDX模型和临床样本中，KK-LC-1在ALDH+细胞中高表达，敲除KK-LC-1减少ALDH+细胞比例和自我更新能力，并抑制肿瘤生长；小分子Z8破坏KK-LC-1/FAT1结合，恢复FAT1表达，激活Hippo通路，降低ALDH+细胞干性和体内肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究为开发针对KK-LC-1的小分子药物以消除乳腺癌干细胞、治疗三阴性乳腺癌提供了临床前依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证KK-LC-1对ALDH+细胞干性的功能影响
检测KK-LC-1是否调控ALDH+细胞的比例、自我更新和成球能力。
通过CRISPR-Cas9敲除MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的KK-LC-1，或使用shRNA敲低，检测ALDH+细胞比例、球体形成能力、自我更新能力（有限稀释法）以及体内成瘤能力。
阐明KK-LC-1调控ALDH+细胞干性的分子机制
确定KK-LC-1是否通过FAT1调节Hippo通路和干性相关基因。
通过RNA-seq和KEGG富集分析确定Hippo通路，通过质谱鉴定FAT1为相互作用蛋白，使用免疫共沉淀验证结合，并检测FAT1的泛素化降解、Hippo通路蛋白磷酸化以及YAP1核定位，同时检测干性转录因子和ALDH1A1的表达。
通过计算筛选和实验验证发现小分子化合物Z8
寻找能够破坏KK-LC-1/FAT1结合的小分子抑制剂。
使用AlphaFold和UniProt获取蛋白结构，ZDOCK进行蛋白-蛋白对接，分子动力学模拟优化，虚拟筛选化合物库，通过生物层干涉技术检测结合亲和力，筛选出Z8，并在细胞中验证其破坏KK-LC-1/FAT1结合、抑制FAT1降解、激活Hippo通路。
评估Z8在体外和体内抑制ALDH+细胞和肿瘤生长的效果
测试Z8是否能够降低ALDH+细胞比例和干性，并抑制体内肿瘤生长。
在细胞培养中，用Z8处理评估ALDH+比例、球体形成能力；在裸鼠移植瘤模型中，给予不同剂量Z8，监测肿瘤体积和重量；在PDX模型中，对比Z8、多西他赛单药及联合用药的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | L15培养基 | Sigma Aldrich | L1518 |
| DMEM培养基 | Sigma Aldrich | D6429 | |
| 5A培养基 | Sigma Aldrich | M8403 | |
| 乳腺上皮细胞培养基 | Procell | CM-0525 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 流式分选 | ALDEFLUOR试剂盒 | STEMCELL Technologies | 01700 |
| PE偶联抗CD24 | Miltenyi Biotec | 130-112-656 | |
| APC偶联抗CD44 | SinoBiological | 12211-MM02-A | |
| 蛋白提取与检测 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Western blot | MG132 | MCE | HY-13259 |
| 巴佛洛霉素A1 | MCE | HY-100558 | |
| 蛋白酶抑制剂 | MCE | HY-K0010 | |
| 磷酸酶抑制剂 | MCE | HY-K0021 | |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Beyotime | P0012S | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光系统 | GE | A680 | |
| RNA提取与qRT-PCR | RNAiso Plus | Takara | 9108 |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR037Q | |
| TB Green Premix Ex Taq | Takara | RR420Q | |
| CFX96系统 | Bio-rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | L1721 |
| 免疫荧光 | 抗YAP1抗体 | Proteintech | 13584-1-AP |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Abcam | ab150077 | |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Abcam | ab150080 | |
| 抗ALDH1A1抗体 | Proteintech | 15910-1-AP | |
| 抗SOX2抗体 | Proteintech | 20118-1-AP | |
| 细胞活力测定 | CCK-8 | DOJINDO | CK04 |
| 酶标仪 | Bio-Tek Instruments | Epoch | |
| 成球实验 | MammoCult基础培养基 | -- | -- |
| MammoCult增殖补充剂 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 超低吸附6孔板 | Corning | -- | |
| 生物层干涉分析 | Forte Bio Octet K2系统 | -- | -- |
| Super Streptavidin (SSA)生物传感器 | -- | -- | |
| 分子对接 | ZDOCK | -- | -- |
| AutoDock Vina | -- | -- | |
| FIPSDock | -- | -- | |
| 分子动力学模拟 | Gromacs | -- | 2020.3 |
| 小分子药物处理 | Z839878730 (Z8) | -- | -- |
| 多西他赛 | -- | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Charles River Japan | -- |
| C57/BL6小鼠 | Vital River Laboratory Animal Technology Company Ltd | -- | |
| NOD/SCID小鼠 | Vital River Laboratory Animal Technology Company Ltd | -- | |
| 统计学分析 | IBM SPSS | SPSS | v22 |
| GraphPad Prism | GraphPad | version |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分选 | 细胞系来源和培养基条件；FACS分选使用的抗体和ALDEFLUOR试剂盒；ALDH+和CD44highCD24low细胞的比例 阅读提示：Methods: Culture of Breast cancer cell lines and Fluorescence-activated cell sorting |
| 基因敲除和敲低 | CRISPR-Cas9靶向序列和电转条件；shRNA序列和转染试剂；敲除/敲低效率验证 阅读提示：Methods: CRISPR-Cas9 mediated ablation of the KK-LC-1 gene and Knockdown and overexpression of the KK-LC-1 gene |
| 体外功能实验 | 成球培养条件（细胞密度、培养基成分）；有限稀释实验的细胞数和孔数；药物处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Sphere formation assay and Limiting dilution assay |
| 分子机制实验 | 蛋白质合成抑制和降解抑制的浓度；免疫共沉淀和泛素化实验的抗体和处理；Hippo通路蛋白磷酸化检测 阅读提示：Methods: Western blotting, Co-immunoprecipitation, and RNA extraction and qRT-PCR |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄和性别；细胞接种数量；药物剂量、给药途径和频率；肿瘤测量和统计设计 阅读提示：Methods: Xenograft studies and PDX models |