筛选和验证CC-115的抗肿瘤活性
从焦亡化合物库中筛选出对LUAD细胞杀伤力最强的化合物。
使用441种焦亡化合物库处理A549和H1650细胞，通过CCK-8和集落形成实验评估细胞活力，确定CC-115为最有效化合物。
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CC-115 通过 Akt/Bax 通路介导肺腺癌中 GSDME 依赖的细胞焦亡
CC-115 Mediates GSDME-Dependent Pyroptosis in Lung Adenocarcinoma Through the Akt/Bax Pathway.
实验完整度
高体外细胞实验、基因敲低/敲除、异种移植小鼠模型及免疫组化等多层级验证，涵盖功能与机制验证。
主要模型
A549细胞 H1650细胞 BALB/C裸鼠皮下异种移植模型
重点核对
CC-115浓度5 μM处理48小时 A549和H1650细胞系 GSDME敲低和Bax敲除 Akt激活剂SC79处理 BALB/C裸鼠，2.5 mg/kg/天腹腔注射
摘要
化疗药物仍然是包括肺癌在内的实体瘤的一线治疗手段，但化疗耐药正在阻碍全球对抗这种疾病的努力。CC-115 是一种用于 I 期临床试验的新型抗肿瘤化合物。然而，尚不清楚 CC-115 是否对肺腺癌（LUAD）有效。在本研究中，我们发现 CC-115 通过细胞肿胀和质膜上形成大泡（与典型的细胞焦亡特征非常相似，一种与化疗相关的程序性细胞死亡）诱导 A549 和 H1650 肿瘤细胞的裂解性死亡。我们证明，CC-115 通过作为 DNA-PK 和 mTOR 的双重抑制剂，在 LUAD 中发挥抗肿瘤作用，该作用是通过 gasdermin E（GSDME）介导的细胞焦亡实现的。CC-115 可以抑制 Akt 磷酸化，削弱其对 Bax 的抑制作用，从而通过 Bax-线粒体固有途径诱导细胞焦亡。CC-115 诱导的细胞焦亡被 Akt 激活剂 SC79 处理或 Bax 缺失所消除。重要的是，在异种移植小鼠模型中，CC-115 显著上调了 Bax 和 GSDME-N 的表达，并减小了肿瘤体积。我们的结果表明，CC-115 通过 Akt/Bax-线粒体固有途径诱导 GSDME 介导的细胞焦亡来抑制肿瘤生长，表明 CC-115 是 LUAD 的一种有前景的治疗药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CC-115是否对肺腺癌有效，以及其诱导细胞死亡的分子机制。
- 核心机制
- CC-115作为DNA-PK和mTOR双重抑制剂，抑制Akt磷酸化，解除Akt对Bax的抑制，激活线粒体固有通路，导致caspase-3活化，切割GSDME产生GSDME-N，引发细胞焦亡。
- 主要证据
- 体外实验中CC-115诱导A549和H1650细胞出现焦亡形态、LDH和IL-1β释放增加；GSDME敲低和Bax敲除减弱此效应；异种移植模型中CC-115减小肿瘤体积，上调Bax和GSDME-N，降低p-Akt。
- 研究意义
- CC-115可能作为提高LUAD化疗效果的潜在药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测CC-115对DNA-PK和mTOR通路的抑制
验证CC-115是否通过抑制DNA-PK和mTOR通路影响细胞存活。
通过Western blot和免疫荧光检测DNA-PK、γH2AX、p-mTOR、p-S6K1等标志物。
验证CC-115诱导细胞焦亡
确定CC-115是否诱导焦亡及其形态学和生化特征。
观察细胞形态，检测LDH释放、IL-1β分泌、Annexin V/7-AAD双阳性细胞，以及caspase-3和GSDME-N的蛋白水平。
敲低GSDME验证其必要性
验证GSDME在CC-115诱导的焦亡中是否必需。
使用shRNA敲低GSDME，评估敲低效率，并检测焦亡相关指标。
验证Akt/Bax信号通路参与
探究CC-115诱导焦亡的分子机制是否涉及Akt/Bax通路。
用SC79激活Akt，或用Bax敲除细胞，检测其对CC-115诱导的线粒体膜电位变化、caspase-3活性和GSDME-N表达的影响。
体内异种移植实验验证抗肿瘤效果
评估CC-115在体内的抗肿瘤效果及GSDME介导的焦亡贡献。
建立皮下异种移植模型，用CC-115处理，测量肿瘤体积和重量，免疫组化检测p-Akt、Bax、cleaved caspase-3和GSDME的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime Biotech | -- |
| 细胞增殖检测 | BrdU ELISA试剂盒 | Beyotime Biotech | -- |
| Western blot | 化学发光辣根过氧化物酶底物 | MilliporeSigma | -- |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Solarbio | -- |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| LDH检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime Biotech | -- |
| IL-1β检测 | QuantiCyto IL-1β ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V-PE/7-AAD检测试剂盒 | KeyGEN | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-10线粒体膜电位检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 显微镜观察 | 奥林巴斯BX51显微镜 | Olympus Corporation | -- |
| 图像处理 | DPC控制器软件 | Olympus Corporation | -- |
| 药物处理 | CC-115 | Selleck Chemicals | -- |
| SC79 | Selleck Chemicals | -- | |
| 焦亡化合物库 | 焦亡化合物库 | Selleck Chemicals | L7400 |
| Western blot | 抗DNA-PK抗体 | Proteintech Group, Inc. | 19983-1-AP |
| 抗mTOR抗体 | Proteintech Group, Inc. | 28273-1-AP | |
| 抗p-mTOR抗体 | Proteintech Group, Inc. | 67778-1-Ig | |
| 抗S6K1抗体 | Proteintech Group, Inc. | 14485-1-AP | |
| 抗Akt抗体 | Proteintech Group, Inc. | 10176-2-AP | |
| 抗p-Akt抗体 | Proteintech Group, Inc. | 66444-1-Ig | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech Group, Inc. | 50599-2-Ig | |
| 抗细胞色素c抗体 | Proteintech Group, Inc. | 10993-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc. | 60004-1-Ig | |
| 抗caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 抗GSDMD-N抗体 | Abcam | ab215203 | |
| 抗caspase-3抗体 | Abcam | ab32351 | |
| 抗GSDME/GSDME-N抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 抗p-DNA-PK抗体 | Abcam | ab124918 | |
| 免疫荧光 | 抗γH2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 |
| Western blot | 抗p-S6K1抗体 | Cell Signaling Technology | 9205S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | A549和H1650细胞系，RPMI-1640培养基，10% FBS，10 mM L-谷氨酰胺，5 mg/mL青霉素/链霉素，37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and Methods, Cell Culture |
| 药物处理 | CC-115浓度：5 μM；处理时间：24-48小时 阅读提示：Materials and Methods, Cell Viability Assay；结果部分图1和图2相关描述 |
| 细胞活力检测 | 96孔板每孔5000个细胞，处理后使用CCK-8检测 阅读提示：Materials and Methods, Cell Viability Assay |
| 集落形成实验 | A549细胞以500细胞/孔接种于60 mm培养皿，培养10天 阅读提示：Materials and Methods, Colony Formation Assay |
| Western blot | 抗体信息：DNA-PK, mTOR, p-mTOR, S6K1, Akt, p-Akt, Bax, cytochrome c, GAPDH, caspase-1, GSDMD, GSDMD-N, caspase-3, GSDME/GSDME-N, p-DNA-PK, γH2AX, p-S6K1 阅读提示：Materials and Methods, Reagents 和 Western Blotting |
| 基因操作 | GSDME shRNA：H_GSDME-shRNA3；Bax sgRNA：序列已提供；Lipofectamine 3000转染 阅读提示：Materials and Methods, GSDME Knockdown and Bax Knockout |
| 线粒体膜电位检测 | JC-10染色，37°C孵育15分钟，处理后48小时 阅读提示：Materials and Methods, Mitochondrial Membrane Potential Assay |
| 动物实验 | BALB/C裸鼠（4-5周龄，14-16 g），A549细胞（1×10^6）皮下注射，CC-115（2.5 mg/kg/天）腹腔注射，7天后开始处理，持续3周 阅读提示：Materials and Methods, Xenograft Mouse Model |