建立索拉非尼耐药细胞模型
构建索拉非尼耐药肝癌细胞模型，用于研究耐药机制。
通过逐步增加索拉非尼浓度处理Huh7和Hep3B细胞，建立耐药细胞系Huh7/SR和Hep3B/SR，并通过CCK-8检测IC50升高和Western blot验证耐药蛋白ABCG2和P-GP高表达。
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二甲双胍通过ATF4/STAT3促进肝细胞癌细胞铁死亡及对索拉非尼的敏感性
Metformin promotes ferroptosis and sensitivity to sorafenib in hepatocellular carcinoma cells via ATF4/STAT3.
实验完整度
高包含体外细胞模型（Huh7/Hep3B及耐药株）和体内小鼠模型，并进行了功能验证（CCK-8、划痕、Transwell）和机制验证（Western blot、免疫荧光、免疫沉淀、ZDOCK预测）。
主要模型
Huh7 和 Hep3B 肝癌细胞系 索拉非尼耐药 Huh7/SR 和 Hep3B/SR 细胞系 裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
索拉非尼耐药细胞诱导方法：逐步增加索拉非尼浓度 二甲双胍处理浓度与时间：文中未明确说明 si-ATF4 和 oe-ATF4 转染条件：使用 Lipofectamine 3000，细胞融合约90% Colivelin（STAT3 激活剂）处理浓度：文中未明确说明 Fer-1（铁死亡抑制剂）处理浓度：文中未明确说明
摘要
肝细胞癌是全球常见的癌症，索拉非尼是治疗晚期肝癌的一线药物。对索拉非尼的耐药已成为治疗肝细胞癌的主要挑战，然而研究表明二甲双胍可促进铁死亡和索拉非尼敏感性。因此，本研究旨在探讨二甲双胍通过ATF4/STAT3促进肝癌细胞铁死亡及索拉非尼敏感性的作用。方法：使用肝癌细胞Huh7和Hep3B以及诱导的索拉非尼耐药（SR）Huh7/SR和Hep3B/SR细胞作为体外细胞模型。皮下注射细胞建立耐药小鼠模型。CCK-8检测细胞活力和索拉非尼IC50。Western blotting检测相关蛋白表达。BODIPY染色分析细胞内脂质过氧化水平。划痕实验检测细胞迁移。Transwell实验检测细胞侵袭。免疫荧光定位ATF4和STAT3的表达。结果：二甲双胍通过ATF4/STAT3促进肝癌细胞铁死亡，降低索拉非尼IC50，增加ROS和脂质过氧化水平，降低细胞迁移和侵袭，抑制肝癌细胞耐药蛋白ABCG2和P-GP的表达，从而抑制肝癌细胞对索拉非尼的耐药。下调ATF4抑制STAT3的磷酸化核转位，促进铁死亡，并增加Huh7细胞对索拉非尼的敏感性。动物模型中也显示二甲双胍通过ATF4/STAT3在体内促进铁死亡和索拉非尼敏感性。结论：二甲双胍通过ATF4/STAT3促进肝癌细胞铁死亡及对索拉非尼的敏感性，并抑制肝癌进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 二甲双胍是否通过ATF4/STAT3通路促进肝癌细胞铁死亡并增强对索拉非尼的敏感性？
- 核心机制
- 二甲双胍通过抑制ATF4表达，进而抑制STAT3的磷酸化核转位，促进铁死亡，从而抑制索拉非尼耐药。
- 主要证据
- 体外实验显示二甲双胍降低索拉非尼IC50、促进ROS和脂质过氧化、抑制耐药蛋白表达；si-ATF4模拟二甲双胍作用，而Colivelin激活STAT3逆转这些效应；免疫共沉淀和ZDOCK预测显示ATF4与STAT3蛋白存在相互作用。
- 研究意义
- 二甲双胍可能增强索拉非尼在肝癌中的疗效，且ATF4和STAT3抑制剂可能在索拉非尼耐药肝癌患者中有进一步应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测二甲双胍对耐药细胞铁死亡的影响
观察二甲双胍能否促进耐药细胞发生铁死亡。
用二甲双胍处理耐药细胞，检测铁死亡相关蛋白GPX4和ACSL4、Fe2+水平、ROS水平和脂质过氧化水平。
验证二甲双胍逆转索拉非尼耐药
评估二甲双胍对索拉非尼耐药细胞增殖、迁移、侵袭和耐药蛋白的影响。
用二甲双胍处理耐药细胞，CCK-8检测细胞活力和IC50，Western blot检测ABCG2和P-GP，划痕实验检测迁移，Transwell检测侵袭。
使用铁死亡抑制剂Fer-1验证二甲双胍作用依赖于铁死亡
验证二甲双胍逆转耐药是否依赖于铁死亡。
在二甲双胍处理的同时加入Fer-1，检测细胞活力、IC50、耐药蛋白、迁移、侵袭及信号通路蛋白表达。
过表达ATF4验证二甲双胍作用机制
验证二甲双胍是否通过抑制ATF4来促进铁死亡并逆转耐药。
在二甲双胍处理的耐药细胞中过表达ATF4（oe-ATF4），并加入铁死亡诱导剂erastin，检测铁死亡相关指标、迁移和侵袭。
验证ATF4与STAT3的相互作用
探究ATF4与STAT3之间的蛋白相互作用模式。
通过免疫荧光定位ATF4和STAT3，免疫共沉淀验证蛋白互作，并使用ZDOCK 3.0.2进行蛋白结合预测。
敲低ATF4并激活STAT3验证通路
验证ATF4/STAT3通路在二甲双胍介导的铁死亡和耐药逆转中的作用。
在耐药细胞中转染si-ATF4敲低ATF4，并加入STAT3激活剂Colivelin，检测信号通路蛋白、铁死亡指标和耐药指标。
体内验证二甲双胍的作用
在动物模型中验证二甲双胍通过ATF4/STAT3促进铁死亡和增强索拉非尼敏感性。
将耐药细胞皮下注射裸鼠建立移植瘤模型，注射二甲双胍，并转染oe-ATF4或添加Colivelin，通过免疫组化、Western blot、流式细胞术检测相关指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 索拉非尼 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Solarbio | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光检测系统 | -- | -- | |
| 铁离子检测 | 铁离子检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | -- | -- |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY荧光染料 | -- | -- |
| Transwell实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 氧化应激检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| GSH检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 免疫组化 | DAB显色液 | -- | -- |
| Mayer苏木素染液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源、培养基组分、培养条件、索拉非尼耐药诱导浓度梯度、二甲双胍浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and processing |
| 转染 | 转染试剂、细胞融合度、质粒和siRNA浓度 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and processing |
| 体内实验 | 动物品系、性别、周龄、体重、细胞注射数量、二甲双胍注射剂量和方式、oe-ATF4转染和Colivelin剂量 阅读提示：Materials and methods, Mouse liver cancer model |
| 细胞功能检测 | CCK-8检测时细胞密度、处理时间；划痕实验细胞密度、划痕后观察时间点；Transwell实验基质胶浓度、细胞数、孵育时间 阅读提示：Materials and methods, CCK-8, Scratch detection, Transwell assays |
| 铁死亡相关检测 | Fe2+检测试剂和方法、ROS检测DCFH-DA孵育时间、BODIPY染色时间、MDA和GSH检测步骤 阅读提示：Materials and methods, Determination of Fe2+, ROS, Lipid peroxidation, MDA and GSH |
| 蛋白检测 | Western blot抗体信息（品牌、货号）、蛋白上样量、一抗稀释比例、孵育条件 阅读提示：Materials and methods, Western blot |