筛选TNBC相关Hub转录因子
识别与TNBC表型高度相关的Hub转录因子基因。
基于TCGA-BRCA队列进行差异表达分析和WGCNA，筛选与Basal亚型显著相关的基因模块，再通过Venn图取交集获得9个Hub TF。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
新型转录因子机器学习模型与靶向药物联合治疗策略在三阴性乳腺癌中的应用
Application of Novel Transcription Factor Machine Learning Model and Targeted Drug Combination Therapy Strategy in Triple Negative Breast Cancer.
实验完整度
高包括基于多队列转录组和单细胞测序的生物信息学分析、细胞实验（CCK-8、RT-qPCR、Western blot）和动物模型（移植瘤）的功能与机制验证。
主要模型
MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系 BALB/C裸鼠原位移植瘤模型 TCGA-BRCA和GEO队列（GSE58812、GSE173839） scRNA-seq队列（GSE176078）
重点核对
HTFSS评分公式：HTFSS = 0.046 × MYBL2Exp − 0.010 × FOXM1Exp − 0.295 × E2F8Exp 细胞实验药物浓度：DOX（125、250、500 ng/mL）、TSA（0.6 μM）、Calcitriol 动物实验给药剂量：DOX（2 mg/kg）、TSA（1 mg/kg）、Calcitriol（0.5 μg/kg），腹腔注射，每3天一次，共21天 MDA-MB-231细胞培养条件：DMEM培养基，10% FBS，1%青链霉素，37°C，5% CO2 Western blot抗体及稀释比例：如GAPDH（ABclonal, AC001, 1:1000）等
摘要
转录因子（TFs）已被证明在肿瘤（包括预后较差的三阴性乳腺癌（TNBC））的发生和发展中发挥关键作用。机器学习广泛用于建立预测模型和筛选关键肿瘤驱动因子。目前的研究缺乏TNBC中TF的整合，因此针对TF预后模型和靶向药物的研究有助于提高临床转化应用。本研究旨在使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）在基于管家基因表达水平进行队列标准化后构建预后TF模型。然后基于分子对接筛选潜在靶向药物，并采用多药联合策略进行体内和体外实验研究。由E2F8、FOXM1和MYBL2构建的TF机器学习模型具有广泛的适用性，一年时AUC值高达0.877。作为高风险临床因素，其异常紊乱可能导致细胞增殖相关通路活性上调。该模型还可用于预测TNBC患者免疫治疗的不良反应。通过分子对接筛选出三种靶向TF的药物：曲古抑菌素A（TSA）、多柔比星（DOX）和骨化三醇。体外和体内实验表明，TSA+DOX能有效降低DOX剂量，TSA+DOX+骨化三醇可能能有效降低DOX对心脏的毒副作用。总之，基于三个TF的机器学习模型为TNBC的临床和预后诊断提供了新的生物标志物，联合靶向药物策略为TNBC治疗提供了新的研究视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在构建集成转录因子的机器学习预后模型，并筛选针对高风险转录因子的联合靶向药物方案，以改善三阴性乳腺癌患者的预后评估和治疗效果。
- 核心机制
- HTFSS中的三个Hub TF（E2F8、FOXM1、MYBL2）在TNBC中高表达，通过上调PI3K-AKT、FOXO、Wnt和mTOR等信号通路促进肿瘤细胞增殖，导致患者预后不良。
- 主要证据
- 通过TCGA-BRCA和验证队列证实HTFSS的预后预测价值（1年AUC 0.877/0.987）；单细胞测序显示E2F8和FOXM1与MKI67+祖细胞相关，MYBL2与浆细胞样树突状细胞相关；细胞和动物实验表明DOX和TSA抑制肿瘤生长，并通过调控PI3K-AKT和FOXO通路发挥作用。
- 研究意义
- HTFSS可作为TNBC独立的临床风险因素，预测淋巴结受累和免疫治疗反应，并已开发基于Nomogram的在线工具；联合靶向药物策略（TSA+DOX±Calcitriol）有助于降低DOX剂量和心脏毒性，为TNBC的个体化治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建并验证HTFSS模型
构建基于LASSO回归的转录因子预后评分系统并验证其性能。
使用LASSO回归从9个Hub TF中筛选出3个（E2F8、FOXM1、MYBL2），并用四个管家基因（ACTB、GAPDH、TFRC、TUBB）标准化后的表达值计算HTFSS。在训练和验证队列中评估ROC曲线和生存分析。
评估HTFSS的临床和免疫治疗预测价值
探究HTFSS与临床病理特征及免疫治疗反应的关系。
通过Cox回归分析HTFSS与临床特征的风险比，构建Nomogram和Shiny App；使用ESTIMATE、ssGSEA和TIGS评估免疫浸润和免疫治疗反应。
单细胞RNA测序分析HTFSS与肿瘤微环境的关系
解析三个Hub TF在单细胞水平上的表达分布及与特定细胞亚群的关联。
对10例TNBC患者的scRNA-seq数据（GSE176078）进行聚类分析，鉴定21种细胞类型，分析E2F8、FOXM1、MYBL2的表达，并计算与标记基因的相关性。
分子对接筛选靶向药物
筛选能够靶向三个Hub TF的潜在药物。
从CTD数据库筛选能降低三个TF mRNA表达的小分子化合物，使用AutoDock v4.2进行分子对接，评估结合能，最终选定DOX、TSA和Calcitriol。
体外细胞实验验证药物效果
验证药物对TNBC细胞增殖的抑制作用及分子机制。
使用MDA-MB-231细胞，通过CCK-8检测细胞活力，RT-qPCR检测TF表达，Western blot检测PI3K-AKT和FOXO通路蛋白。
体内动物实验验证药物组合效果
评估药物组合在体内对肿瘤生长和心脏毒性的影响。
将MDA-MB-231细胞接种于BALB/C裸鼠，建立原位移植瘤模型，分为对照组、TSA组、DOX组、TSA+DOX组、TSA+DOX+Calcitriol组，腹腔注射给药，测量肿瘤体积、体重，并通过IHC和HE染色评估Ki67和心脏病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco, Thermo Scientific | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Procell | 164210-500 | |
| 药物处理 | 曲古抑菌素A（TSA） | MCE | HY-15144 |
| 骨化三醇 | MCE | HY-10002 | |
| 多柔比星（DOX） | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 反转录 | Hifair III 第一链cDNA合成SuperMix（qPCR） | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | -- |
| RT-qPCR | FastStart Universal SYBR Green预混液 | Roche | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| GAPDH抗体 | ABclonal | AC001 | |
| β-Actin抗体 | Abclonal | AC026 | |
| Vinculin抗体 | Bioss | bs-6640R | |
| PI3K抗体 | CST | 4257S | |
| AKT抗体 | CST | 4691S | |
| mTOR抗体 | CST | 2972S | |
| P70抗体 | CST | 2708S | |
| S6抗体 | CST | 2217S | |
| 4EBP1抗体 | CST | 9452S | |
| p-P70抗体 | CST | 9234S | |
| p-S6抗体 | CST | 5364S | |
| p-4EBP1抗体 | CST | 9451S | |
| FoxO1抗体 | Millipore | 05-1075 | |
| FoxO3抗体 | CST | 12829P | |
| p-FoxO1抗体 | CST | 9464P | |
| p-FoxO3抗体 | CST | 9465P | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Abcam | AB16667 |
| HRP标记兔/鼠二抗 | Dako, Agilent Technologies | -- | |
| 统计软件 | R语言 | -- | -- |
| GraphPad Prism | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HTFSS模型构建 | 四个管家基因（ACTB, GAPDH, TFRC, TUBB）的表达值用于标准化，LASSO回归的λ值及交叉验证细节 阅读提示：Materials and Methods 4.3节 |
| 细胞培养 | MDA-MB-231细胞培养条件：DMEM培养基、10% FBS、1%青霉素/链霉素、37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and Methods 4.8.1节 |
| 药物处理 | DOX浓度梯度（125, 250, 500 ng/mL），TSA浓度（0.6 μM），Calcitriol浓度，处理时间48小时 阅读提示：Methods 4.8.2和4.8.4节，Figure 9图注 |
| RT-qPCR条件 | 内参基因（GAPDH），引物序列（Table S1），反转录试剂盒型号，SYBR Green Master品牌 阅读提示：Methods 4.8.3节，Table S1 |
| Western blot条件 | 抗体目录号、稀释倍数（如1:1000），蛋白上样量、电泳转膜条件 阅读提示：Methods 4.8.4节，Table S1 |
| 动物实验 | 动物品系（BALB/C裸鼠）、周龄（6周）、性别（雌性）、细胞注射量（1×10^6）、给药剂量（DOX 2 mg/kg, TSA 1 mg/kg, Calcitriol 0.5 μg/kg）、给药频率（每3天一次）、时长（21天） 阅读提示：Methods 4.9.1节，Figure 10图注 |
| 免疫组化条件 | Ki67抗体稀释度（1:500）、抗原修复条件、二抗信息 阅读提示：Methods 4.9.2节 |