菌株筛选与OGT胁迫耐受性评估
筛选出对模拟口腔-胃肠道胁迫具有高耐受性的乳酸菌菌株。
对25株乳酸菌进行连续模拟唾液、胃液、肠液处理，测定存活率。
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模拟口腔-胃肠道转运胁迫对植物乳杆菌S7黏附的调控
The regulation of simulated artificial oro-gastrointestinal transit stress on the adhesion of Lactobacillus plantarum S7.
实验完整度
高包含体外模拟OGT胁迫实验、黏附试验、关键黏附素去除、TEM观察、TMT蛋白质组学及GO/KEGG通路分析等多个独立证据层级，并含功能验证和机制验证。
主要模型
植物乳杆菌S7 Caco-2细胞 猪胃黏蛋白
重点核对
OGT胁迫条件：模拟唾液（含100 mg/L溶菌酶，pH 7.0，5 min）、胃液（含3.0 g/L胃蛋白酶，pH 3.0，3 h）、肠液（含0.1%胰酶和0.15%或0.30%胆盐，pH 8.0，2 h） 黏附测定：Caco-2细胞单层和猪胃黏蛋白包被的24孔板，LAB浓度108 CFU/mL，37°C孵育2 h 关键黏附素去除：5 mol/L LiCl处理去除表面蛋白，50 mmol/L NaIO4处理去除EPS，2% BSA处理去除脂磷壁酸 蛋白质组学分析：TMT标记、LC-MS/MS，DEPs筛选标准为FC>1.2或<0.83且P<0.05 统计方法：采用Tukey多重比较检验，P<0.05为显著差异
摘要
背景：消化道中的口腔-胃肠道胁迫是口服益生菌所面临的主要胁迫。本研究探讨了连续暴露于模拟唾液-胃液-肠液时，口腔-胃肠道转运（OGT）胁迫对益生菌黏附和存活的影响。结果：植物乳杆菌S7在模拟OGT1（含0.15%胆盐）和OGT2（含0.30%胆盐）胁迫后具有较高的存活率。OGT1胁迫显著提高了植物乳杆菌S7的黏附能力（P < 0.05），而OGT2胁迫对其影响不显著（P > 0.05），细胞表面物质厚度的变化趋势也与此一致。OGT胁迫显著下调了植物乳杆菌S7表面蛋白如30S核糖体蛋白、黏液结合蛋白和S层蛋白的表达（P < 0.05）；同时，显著上调了多功能蛋白如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、β-磷酸葡萄糖变位酶（PGM1）、GroEL和葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）的表达（P < 0.05）。然而，OGT1胁迫对GAPDH、PGK、PGM1和PGI的上调幅度大于OGT2胁迫。与无OGT胁迫的细胞相比，OGT胁迫显著改变了植物乳杆菌S7的群体感应通路（P < 0.05），其中LuxS的表达在OGT1胁迫下显著上调（P < 0.05）。OGT1胁迫显著改变了ABC转运通路（P < 0.05），其中肽ABC转运底物结合蛋白和能量偶联因子转运ATP结合蛋白EcfA的表达在OGT胁迫下显著上调（P < 0.05）。与OGT2胁迫相比，OGT1胁迫显著改变了甘油代谢通路（P < 0.05）。结论：植物乳杆菌S7具有较强的抵抗OGT胁迫的能力，这种能力受与OGT胁迫相关的蛋白质和通路的调控。连续暴露于OGT1胁迫后，植物乳杆菌S7的黏附能力增强，使其成为一种具有广阔应用前景的潜在益生菌。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 模拟口腔-胃肠道转运胁迫如何调控植物乳杆菌S7的黏附能力？
- 核心机制
- OGT1胁迫通过上调多功能蛋白（如GAPDH、PGK、PGM1、PGI）和与EPS、脂磷壁酸合成相关蛋白的表达，同时上调群体感应通路中LuxS的表达，促进EPS产生，从而增强黏附能力；OGT2胁迫则造成更大的损伤，黏附未显著增强。
- 主要证据
- 体外模拟OGT胁迫实验显示OGT1显著提高S7黏附率（P<0.05），表面物质厚度从61.46 nm增至80.34 nm；TMT蛋白质组学分析显示相关蛋白表达上调，且表面蛋白和EPS去除实验证实其关键黏附素作用。
- 研究意义
- 研究为筛选高肠道黏附益生菌及开发相关产品提供理论依据，并提高功能性益生菌在生产应用中的效率。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
黏附能力评估
评估菌株对肠道黏蛋白和Caco-2细胞的黏附能力，并选择代表性菌株。
选用猪胃黏蛋白包被板和Caco-2细胞单层，测定各菌株的黏附率，并分析两者的相关性。
OGT胁迫对黏附的影响及关键黏附素鉴定
明确OGT胁迫对S7黏附的影响，并鉴定关键黏附素。
对S7进行OGT1和OGT2胁迫处理，测定黏附率变化；用LiCl、NaIO4和BSA处理去除表面蛋白、EPS和脂磷壁酸，比较处理前后的黏附率。
细胞表面形态观察
观察OGT胁迫对细胞表面物质厚度的影响。
使用透射电子显微镜（TEM）观察S7在无胁迫和OGT1、OGT2胁迫后的细胞形态，并统计表面厚度。
蛋白质组学分析
分析OGT胁迫下S7的差异表达蛋白及相关通路。
提取S7在无胁迫、OGT1和OGT2胁迫下的总蛋白，进行TMT标记和LC-MS/MS分析，鉴定和定量差异表达蛋白，并进行GO和KEGG富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 模拟OGT胁迫 | 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胃蛋白酶 | Sangon Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 胰酶 | Sangon Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 牛胆盐 | Solabo Technology Co., Ltd. | -- | |
| 黏附试验 | 猪胃黏蛋白（II型） | Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. | -- |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | Life Technologies, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Clark bioscience | -- | |
| 非必需氨基酸 | Life Technologies, Inc. | -- | |
| GlutaMAX | Life Technologies, Inc. | -- | |
| 关键黏附素去除 | 氯化锂 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 牛血清白蛋白 | Sangon Biotech Co., Ltd. | -- | |
| TEM观察 | FEI Tecnai G2 spirit | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| 锇酸 | -- | -- | |
| Spurr低黏度包埋树脂 | -- | -- | |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| 蛋白质提取 | SDT缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白质消化 | C18色谱柱 | Empore | -- |
| LC-MS/MS | Easy nLC系统1200 | Thermo Scientific | -- |
| Q Exactive plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 捕集柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100） | Thermo Scientific | -- | |
| 分析柱（Thermo Scientific EASY column） | Thermo Scientific | -- | |
| TMT标记 | iTRAQ试剂 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模拟OGT胁迫 | 模拟唾液、胃液、肠液的成分、pH、处理时间及温度；胆盐浓度（0.15%或0.30%）。 阅读提示：Methods: Tolerance to simulated artificial orogastrointestinal transit (OGT) stress |
| 黏附试验 | 黏蛋白浓度、包被条件；Caco-2细胞培养条件、接种浓度；菌液浓度、孵育时间；洗涤和释放处理。 阅读提示：Methods: Adhesion to intestinal mucin in vitro; Adhesion to Caco-2 cells in vitro |
| 关键黏附素去除 | LiCl、NaIO4、BSA的处理浓度、时间、温度、转速。 阅读提示：Methods: Key adhesins of the LAB cell surface |
| TEM观察 | 固定液浓度、固定时间、脱水系列、包埋试剂及时间、染色步骤。 阅读提示：Methods: Transmission electron microscopy (TEM) observation |
| 蛋白质组学分析 | 蛋白质提取缓冲液、定量方法、酶解方法、TMT标记条件、LC-MS/MS参数、搜库软件及数据库、差异蛋白筛选阈值。 阅读提示：Methods: Protein isolation and digestion; Tandem mass tag (TMT) labeling and LC–MS/MS analysis; Protein identification and quantification and bioinformatics |