临床样本验证
检测AR患者鼻黏膜组织中RORα的表达水平及病理变化。
收集AR患者和健康对照鼻黏膜组织，进行H&E染色和免疫组化检测RORα。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
RORα过表达通过诱导自噬降低白细胞介素-33表达并抑制变应性鼻炎中的肥大细胞脱颗粒和炎症
RORα overexpression reduced interleukin-33 expression and prevented mast cell degranulation and inflammation by inducing autophagy in allergic rhinitis.
实验完整度
高包含患者组织样本、体外细胞共培养、小鼠体内模型等多个证据层级，并进行了过表达/沉默及自噬抑制剂救援实验的功能与机制验证。
主要模型
人鼻上皮细胞系HNEpC 人肥大细胞系LAD2 BALB/C小鼠AR模型（OVA诱导） AR患者鼻黏膜组织
重点核对
Derp1处理浓度（0、5、10、15 μg/mL） RORα过表达质粒或siRNA转染效率 LAD2细胞与HNEpC细胞非接触共培养比例（1:5）及时间（24h） OVA诱导小鼠模型：腹腔注射7次，5% OVA滴鼻20μL/天，持续7天 自噬抑制剂3-MA处理
摘要
背景：维甲酸受体相关孤儿受体α（RORα）是一种核受体，与其他生物活性因子一起在体内调节细胞增殖、分化和免疫调节。目的：本研究旨在探讨RORα在变应性鼻炎（AR）中的功能和机制。材料与方法：采用Derp1在HNEpC细胞中构建AR细胞模型，并在AR HNEpC细胞中过表达或沉默RORα。接着，LAD2细胞与Derp1处理的HNEpC细胞共培养。此外，用OVA建立AR小鼠模型，并通过雾化递送RORα腺病毒。采用苏木精-伊红染色评估病理组织结构，通过免疫组织化学、蛋白质印迹和免疫荧光染色分析RORα、白细胞介素-33（IL-33）和其他蛋白的水平。使用酶联免疫吸附测定试剂盒检测IL-33、IL-4、IL-5和IL-13的水平，并使用Transwell实验评估细胞迁移。结果：我们的数据显示，AR患者鼻黏膜组织中RORα下调。Derp1处理可导致HNEpC细胞中RORα下调、IL-33上调、NLRP3炎性小体诱导和细胞迁移。此外，RORα过表达显著减弱Derp1诱导的AR HNEpC细胞中的IL-33水平、NLRP3炎性小体活性和迁移。此外，AR HNEpC细胞中的RORα可以通过加速自噬来阻止肥大细胞（MC）脱颗粒和炎症，RORα过表达抑制了AR模型小鼠中的MC脱颗粒和NLRP3诱导的炎症。RORα过表达降低了鼻上皮细胞中IL-33的表达，并通过促进自噬抑制了MC脱颗粒和炎症。结论：RORα抑制HNEpC中的NLRP3炎性小体，并通过自噬减弱肥大细胞脱颗粒和炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RORα在变应性鼻炎中是否通过调节IL-33表达和自噬影响肥大细胞脱颗粒及炎症反应？
- 核心机制
- RORα通过促进自噬抑制NLRP3炎性小体活性，降低IL-33表达，从而抑制肥大细胞脱颗粒和炎症。
- 主要证据
- 在Derp1诱导的HNEpC细胞中，RORα过表达降低IL-33、NLRP3、Caspase-1、ASC表达及细胞迁移；在共培养体系中，RORα过表达减少肥大细胞β-己糖胺酶、组胺和类胰蛋白酶释放，增加自噬标志物；在OVA诱导的AR小鼠模型中，RORα腺病毒降低IgE、组胺、IL-4、IL-5、IL-13、IL-33水平，并改善鼻黏膜病理。
- 研究意义
- 该研究表明RORα可能是AR治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建AR细胞模型及检测RORα表达
验证Derp1对HNEpC细胞中RORα表达的影响。
用不同浓度Derp1（0,5,10,15μg/mL）处理HNEpC细胞，通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光检测RORα表达。
检测Derp1对IL-33、NLRP3炎性小体及细胞迁移的影响
评估Derp1诱导的AR细胞模型中IL-33表达、NLRP3炎性小体激活和细胞迁移。
ELISA检测IL-33水平，免疫荧光检测IL-33表达，Western blot检测NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白，Transwell实验检测细胞迁移。
RORα过表达和沉默验证
确认RORα过表达质粒和siRNA的转染效率。
HNEpC细胞转染RORα siRNA（#1,#2,#3）或过表达质粒，通过RT-qPCR和Western blot检测RORα表达。
RORα对AR细胞模型功能的影响
探究RORα过表达或沉默对AR HNEpC细胞中IL-33、NLRP3炎性小体和迁移的影响。
在Derp1处理的HNEpC细胞中过表达或沉默RORα，检测IL-33水平、NLRP3炎性小体相关蛋白和细胞迁移。
共培养体系评估RORα对肥大细胞功能的影响
验证AR HNEpC细胞中RORα对肥大细胞脱颗粒、自噬和炎症的作用。
将LAD2细胞与转染后的HNEpC细胞共培养，检测β-己糖胺酶、组胺、类胰蛋白酶、自噬蛋白及细胞因子。
自噬抑制剂救援实验
验证自噬在RORα介导的肥大细胞功能调节中的作用。
用自噬抑制剂3-MA处理AR HNEpC细胞，再与LAD2共培养，检测脱颗粒、自噬和炎症指标。
动物模型体内验证
验证RORα在体内对AR小鼠模型的影响。
OVA诱导BALB/C小鼠AR模型，雾化给予RORα腺病毒，检测IgE、组胺、细胞因子、自噬及炎性相关蛋白和鼻黏膜病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Sigma | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂盒 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | Bestar™ qPCR RT试剂盒 | DBI Bioscience | -- |
| SYBR Green qPCR Mix试剂盒 | Sparkjade | -- | |
| Western blotting | PVDF膜 | Merck | -- |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| RORα抗体 | Novus Biologicals | NBP1-52813 | |
| LC3抗体 | Boster | PA01524 | |
| Beclin 1抗体 | Boster | PB9076 | |
| p62抗体 | Boster | PB0458 | |
| NLRP3抗体 | Proteintech | 27458-1-AP | |
| Caspase 1抗体 | Proteintech | 81482-1-RR | |
| ASC抗体 | Proteintech | 10500-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Servicebio | GB15002 | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo | -- | |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗兔IgG | -- | -- |
| DAPI染色液 | Sigma | -- | |
| ELISA | IL-33 ELISA试剂盒 | -- | -- |
| β-己糖胺酶ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| 组胺ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| 类胰蛋白酶ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| IL-4 ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| IL-5 ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| IL-13 ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| IgE ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | Hitachi | H-500 |
| 动物实验 | 卵清蛋白 | -- | -- |
| RORα腺病毒 | -- | -- | |
| 3-甲基腺嘌呤（自噬抑制剂） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本 | AR患者和健康对照鼻黏膜组织来源、样本量 阅读提示：Methods 2.1 Tissue samples |
| 细胞培养 | HNEpC和LAD2细胞培养条件（培养基、血清、双抗浓度） 阅读提示：Methods 2.2 Cell culture |
| AR细胞模型构建 | Derp1浓度（0、5、10、15 μg/mL）和处理时间 阅读提示：Methods 2.3 Cell treatment and co-culture |
| RORα过表达/沉默 | RORα质粒、siRNA序列、转染试剂及转染时间（48h） 阅读提示：Methods 2.3 Cell treatment and co-culture |
| 共培养体系 | 上室与下室细胞比例（1:5）及共培养时间（24h） 阅读提示：Methods 2.3 Cell treatment and co-culture |
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、周龄、体重，OVA腹腔注射次数及剂量，OVA滴鼻浓度和体积，RORα腺病毒给药方式 阅读提示：Methods 2.4 Experimental animals, 2.5 Construction of the AR mouse model |
| 自噬抑制实验 | 3-MA处理浓度和时间 阅读提示：Results 3.8, Figure 8 |