构建SPOP过表达的人正常肝细胞模型
验证SPOP过表达对WRL68细胞增殖的影响。
使用SPOP过表达慢病毒和空载体病毒转染WRL68细胞，经嘌呤霉素筛选后通过qRT-PCR验证SPOP表达。
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SPOP调控人肝细胞中的表达谱和可变剪接事件
SPOP regulates the expression profiles and alternative splicing events in human hepatocytes.
实验完整度
中包含细胞增殖实验（CCK8、克隆形成）、转录组测序及qRT-PCR验证、可变剪接分析及公共数据库生存分析，但缺乏动物模型或临床样本的功能验证。
主要模型
人正常肝细胞WRL68 SPOP过表达WRL68细胞模型
重点核对
SPOP过表达慢病毒转染WRL68细胞，并经1.5 μg/mL嘌呤霉素筛选2周 CCK8实验细胞密度1×10^3细胞/孔，培养24、48、72、96小时 克隆形成实验细胞密度1×10^3细胞/孔，培养2周 RNA-seq每组3个生物学重复，差异基因筛选阈值|log2FC|>0且padj<0.05 TCGA数据包含374例HCC与50例正常对照
摘要
斑点型BTB/POZ蛋白（SPOP）可能具有促进或抑制癌症的作用。目前，SPOP在肝细胞癌（HCC）中的作用研究很少。在本研究中，为了探讨SPOP在HCC中的作用并阐明其与基因关系的潜在分子机制，通过RNA测序对差异表达基因（DEGs）进行了分类。利用基因本体论分析和京都基因与基因组百科全书功能通路分析进一步预测SPOP过表达后DEGs的功能。全面评估了SPOP调控的可变剪接事件在细胞中的生物学功能。利用癌症基因组图谱数据库和基因表达综合数据集评估SPOP与HCC进展的相关性。由于SPOP过表达，进一步鉴定出HCC相关通路中的56个DEGs。结果表明，SPOP过表达促进了人正常肝细胞的增殖并改变了其基因表达谱。SPOP调控的可变剪接事件涉及与细胞过程、代谢、环境信息处理、有机体系统等相关的通路。总之，SPOP可能具有潜在的促肿瘤作用，需要进一步研究以全面揭示其分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SPOP在肝细胞癌中的作用及其调控基因表达和可变剪接的分子机制尚不清楚。
- 核心机制
- SPOP过表达可能通过下调TGF-β/SMAD3信号通路和激活c-Met及其下游PI3K/Akt和RAS/MAPK通路，促进细胞增殖和肿瘤进展。
- 主要证据
- SPOP过表达促进WRL68细胞增殖（CCK8和克隆形成实验）；RNA-seq鉴定出3838个DEGs（1522上调，2316下调）和158个RASEs；公共数据库分析显示SPOP在HCC中高表达且与不良预后相关。
- 研究意义
- SPOP可能作为HCC潜在的促肿瘤因子，为理解HCC发病机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测SPOP过表达对细胞增殖的影响
评估SPOP过表达是否促进WRL68细胞增殖。
采用CCK8实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力。
RNA测序分析基因表达谱和可变剪接事件
鉴定SPOP过表达后差异表达基因和可变剪接事件。
对SPOP组和vec组细胞进行RNA-seq，分析DEGs和RASEs，并进行GO和KEGG富集分析。
公共数据库生物信息学分析
评估SPOP表达与HCC进展及预后的相关性。
利用TCGA和GEO数据库分析SPOP在HCC组织和正常组织中的表达差异，并分析与临床病理参数和生存期的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Procell | PM150210 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668027 |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Vazyme | R401-01 |
| 反转录 | Hiscript III逆转录酶 | Vazyme | R302-01 |
| qRT-PCR | Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-02 |
| LightCycler 96SW1.1实时荧光定量PCR系统 | Roche | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0038 |
| RNA-seq | RNA Nano 6000检测试剂盒 | -- | -- |
| NEBNext Ultra定向RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | WRL68细胞来源、培养基、血清浓度、抗生素浓度。 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| SPOP过表达 | 慢病毒构造、转染试剂、筛选浓度和时间。 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| 细胞增殖实验 | CCK8实验的细胞密度、培养时间、检测波长；克隆形成实验的细胞密度、培养时间、染色方法。 阅读提示：Materials and Methods 2.3, 2.4 |
| RNA-seq | 建库试剂盒、测序平台、读长、比对软件及参数、差异表达分析软件及阈值。 阅读提示：Materials and Methods 2.5-2.9 |
| 公共数据分析 | TCGA数据集中HCC和正常样本的数量、GEO数据集编号、生存分析工具。 阅读提示：Materials and Methods 2.10 |