LCSCs分选与RNA-seq分析
鉴定LCSCs中差异表达的基因，发现HOTAIR高表达
通过流式分选获得CD13+CD133+肝癌干细胞，进行RNA-seq分析差异表达基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
JMJD6-BRD4复合物通过结合HOTAIR启动子区刺激lncRNA HOTAIR转录并诱导肝癌干细胞放射抗性
JMJD6-BRD4 complex stimulates lncRNA HOTAIR transcription by binding to the promoter region of HOTAIR and induces radioresistance in liver cancer stem cells.
实验完整度
高包含临床样本分析、细胞功能实验、机制验证（ChIP、RIP）、体内裸鼠成瘤实验及抑制剂验证，多层级证据链。
主要模型
CD13+CD133+肝癌干细胞（Hep3B和Huh7） 肝癌组织样本 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
细胞系：Hep3B和Huh7肝癌细胞系 放射剂量：6 Gy X-ray（体外），10 Gy（体内） JMJD6抑制剂SKLB325浓度：4 μM 分组：shCtl, shHOTAIR, shJMJD6, shLSD1, oe-ERK2等 检测终点：微球形成、克隆形成、肿瘤体积和重量
摘要
背景：长链非编码RNA（lncRNA）HOTAIR在肝癌发展中发挥重要作用，但其对放射抗性的影响仍知之甚少。本研究探讨了HOTAIR在肝癌干细胞（LCSCs）放射抗性中的可能影响，并阐明其分子基础。方法：分选干细胞和非干细胞肝癌细胞后，鉴定LCSCs并进行RNA-seq分析以选择差异表达基因。检测肝癌组织和癌症干细胞中HOTAIR的表达。然后检测LCSCs的干性、增殖、凋亡和放射抗性，以响应HOTAIR-LSD1-JMJD6-BRD4表达的改变。结果：发现异位HOTAIR表达通过维持LCSCs的干性促进其放射抗性。机制研究表明，HOTAIR将LSD1招募到MAPK1启动子区域，并降低启动子区域H3K9me2的水平，从而升高ERK2（MAPK1）表达。JMJD6–BRD4复合物通过形成复合物促进HOTAIR转录，并正向调节ERK2（MAPK1）表达，维持LCSCs的干性，最终在体外和体内促进其放射抗性。结论：总之，我们的工作强调了JMJD6–BRD4复合物通过HOTAIR依赖性机制对LCSCs放射抗性的促进作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HOTAIR及其上游调控因子JMJD6-BRD4复合物是否通过影响LCSCs干性来影响肝癌放射抗性，其分子机制是什么？
- 核心机制
- JMJD6-BRD4复合物结合HOTAIR启动子促进其转录，HOTAIR作为支架招募LSD1至MAPK1启动子降低H3K9me2水平，上调ERK2（MAPK1）表达，维持LCSCs干性并增强放射抗性。
- 主要证据
- 临床样本分析显示HOTAIR、LSD1、ERK2高表达与不良预后相关；细胞实验表明HOTAIR、LSD1、ERK2调控干性和放射抗性；ChIP证明HOTAIR招募LSD1至MAPK1启动子；RIP证明HOTAIR与LSD1、BRD4与LSD1相互作用；体内实验验证JMJD6沉默抑制肿瘤生长并增加凋亡。
- 研究意义
- 为肝癌放射抗性提供潜在治疗靶点和生物标志物
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床样本验证
验证HOTAIR及相关蛋白在肝癌组织中的表达及预后相关性
使用TCGA数据库和临床组织样本，通过RT-qPCR和免疫组化检测HOTAIR、LSD1、ERK2表达，并分析其与预后的关系。
细胞功能实验
验证HOTAIR、LSD1、ERK2对LCSCs干性和放射抗性的影响
在LCSCs中敲低或过表达HOTAIR、LSD1、ERK2，检测微球形成能力和克隆形成能力。
机制验证
阐明HOTAIR-LSD1-ERK2轴的分子机制
通过ChIP检测LSD1和H3K9me2在MAPK1启动子的富集，通过RIP验证HOTAIR与LSD1、BRD4与LSD1的相互作用。
体内实验验证
验证JMJD6沉默或SKLB325处理对LCSCs放射抗性的影响
将处理后的Hep3B CSCs皮下注射裸鼠，进行X-ray照射，检测肿瘤体积、重量、增殖和凋亡。
抑制剂药效评估
评估JMJD6抑制剂SKLB325对LCSCs干性和放射抗性的抑制作用
使用SKLB325处理LCSCs和裸鼠，检测HOTAIR、MAPK1表达，微球形成和克隆形成能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞分选 | CD13抗体 | eBioscience | 11-0138 |
| CD133抗体 | Miltenyi Biotec | 130-098-826 | |
| 流式分析 | 流式细胞仪（BD FACSVerse） | BD | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | JMJD6抗体 | Abcam | ab64575 |
| LSD1抗体 | Abcam | ab17721 | |
| ERK2 (MAPK1)抗体 | CST | 9926 | |
| BRD4抗体 | Abcam | ab75898 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 免疫组织化学 | JMJD6抗体（IHC） | Abcam | ab256798 |
| LSD1抗体（IHC） | Abcam | ab129195 | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 羊抗兔IgG | Abcam | ab6785 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂盒 | Invitrogen | -- |
| cDNA逆转录试剂盒 | Beijing Yaanda Biotechnology | K1622 | |
| 荧光定量PCR系统（ViiA 7） | Da An gene | -- | |
| ChIP-PCR | JMJD6抗体 | Proteintech | 16476-1-AP |
| LSD1抗体 | CST | 2139 | |
| H3K9me2抗体 | Abcam | ab1220 | |
| BRD4抗体 | CST | 83375 | |
| RIP assay | Magna RIP™ RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| LSD1抗体 | CST | 2139 | |
| BRD4抗体 | CST | 83375 | |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 药物处理 | SKLB325 | -- | -- |
| 放射治疗 | X射线检查系统（型号120D） | Scanray Corporation | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分选 | 细胞系（Hep3B, Huh7），分选标记（CD13, CD133），培养基（DMEM+10% FBS） 阅读提示：见Materials and methods中的Cell culture和CD13+ and CD133+ cell sorting |
| 放射处理 | 放射剂量（6 Gy体外，10 Gy体内），剂量率（0.341 Gy/min），辐射面积（10cm×10cm） 阅读提示：见Materials and methods中的Radiosensitivity experiment和Radiotherapy treatment |
| 功能实验 | 微球形成实验条件（无血清培养基、低粘附板、培养2周），克隆形成实验（6孔板、照射后培养7天） 阅读提示：见Materials and methods中的Microsphere formation assay和Clonogenic assay |
| 机制实验 | ChIP抗体（JMJD6, LSD1, H3K9me2, BRD4），RIP抗体（LSD1, BRD4） 阅读提示：见Materials and methods中的ChIP-PCR assay和RIP assay |
| 体内实验 | 细胞数（6×10^6），照射剂量（10 Gy），分组（5组，每组6只），SKLB325给药方案（每周一次×4周） 阅读提示：见Materials and methods中的Cellular tumorigenicity in nude mice |