外泌体分离与鉴定
获得并验证BMSC来源的外泌体。
使用ExoQuick-TC从BMSC培养上清中沉淀外泌体，通过TEM观察形态，NTA分析粒径，Western blot检测标志物，PKH26染色示踪。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
骨髓间充质干细胞来源的外泌体microRNA调节小胶质细胞极化
Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomal microRNA regulates microglial polarization.
实验完整度
中包含体外细胞实验（OGD模型、外泌体处理、流式、双荧光素酶等）及机制验证，但缺乏动物模型或体内验证，证据层级相对单一。
主要模型
BV-2小胶质细胞系 BMSC来源外泌体 OGD暴露的BV-2细胞
重点核对
外泌体分离方法：ExoQuick-TC沉淀法 OGD建模条件：无糖DMEM、1% O2、4小时 外泌体处理浓度：15 µg/mL miR-146a-5p模拟物和抑制剂转染 Traf6基因敲低和过表达质粒
摘要
目的：本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的外泌体miR-146a-5p对氧糖剥夺（OGD）暴露的小胶质细胞极化的影响及其潜在机制。方法：从BMSC中分离外泌体，并检测其特性。在OGD暴露的BV-2细胞中研究BMSC来源外泌体对小胶质细胞极化的影响。鉴定差异表达的miRNA，并通过富集分析探索其生物学功能。通过流式细胞术研究miR-146a-5p在小胶质细胞极化中的调节作用。最后，验证下游靶基因Traf6，并在OGD暴露的BV-2细胞中研究miR-146a-5p/Traf6轴在调节小胶质细胞极化中的作用。结果：成功分离并鉴定了BMSC来源的外泌体。共鉴定出10个上调和33个下调的miRNA。外泌体处理导致小胶质细胞极化标志物显著变化。发现miR-146a-5p在OGD暴露并用外泌体处理的小胶质细胞中显著下调。miR-146a-5p表达的调控调节了小胶质细胞极化。此外，miR-146a-5p/Traf6轴调节小胶质细胞极化。结论：我们的研究结果表明，BMSC来源的外泌体通过靶向Traf6的miR-146a-5p调节小胶质细胞极化，为涉及小胶质细胞激活的神经系统疾病的治疗提供了潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BMSC来源的外泌体如何通过miRNA调节小胶质细胞极化以及其潜在机制。
- 核心机制
- BMSC来源外泌体中的miR-146a-5p通过靶向Traf6并负调控其表达，抑制小胶质细胞向M1表型极化，从而调节小胶质细胞极化。
- 主要证据
- 体外OGD暴露的BV-2细胞中，外泌体处理后miR-146a-5p显著下调；miR-146a-5p模拟物/抑制剂改变CD40、CD86和CD206表达；双荧光素酶报告实验验证miR-146a-5p靶向Traf6 3'UTR；共转染实验表明miR-146a-5p/Traf6轴调节CD86和CD206表达。
- 研究意义
- 为神经炎症疾病的治疗提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外泌体对OGD暴露BV-2细胞极化的影响
评估外泌体处理对OGD诱导的细胞凋亡和极化标志物表达的影响。
对BV-2细胞进行OGD建模，并用外泌体处理，随后通过流式细胞术检测凋亡和CD40、CD86、CD206表达。
miRNA鉴定与差异表达分析
识别外泌体处理后差异表达的miRNA。
提取RNA，进行小RNA测序，使用edgeR分析差异表达，并利用TargetScan等预测靶基因及富集分析。
验证miR-146a-5p对极化的影响
验证miR-146a-5p在小胶质细胞极化中的作用。
在OGD暴露的BV-2细胞中转染miR-146a-5p模拟物或抑制剂，检测CD40、CD86和CD206表达。
验证miR-146a-5p靶向Traf6及轴的作用
验证miR-146a-5p是否直接靶向Traf6，并研究miR-146a-5p/Traf6轴对极化的影响。
通过双荧光素酶报告实验验证miR-146a-5p与Traf6 3'UTR的结合；通过Western blot和RT-qPCR检测Traf6表达；共转染miR-146a-5p模拟物和Traf6过表达质粒或miR-146a-5p抑制剂和sh-Traf6，检测极化标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 外泌体分离 | ExoQuick-TC外泌体沉淀试剂 | System Biosciences | -- |
| 外泌体鉴定 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| TSG101抗体 | Abcam | ab125011 | |
| CD9抗体 | Abcam | ab236630 | |
| Calnexin抗体 | Cell Signaling Technology | 2679 | |
| 二抗 | CST | 7076 | |
| PKH26染料 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC | Sangon Biotech | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| CD40-FITC抗体 | Biolegend | 124607 | |
| CD86-PE抗体 | Biolegend | 105007 | |
| CD206-FITC抗体 | BioLegend | 141703 | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| miRNA测序 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | 反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
| 双重荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 外泌体鉴定 | 透射电子显微镜 | JEOL Ltd | -- |
| Zetasizer Nano ZS粒度仪 | Malvern Panalytical | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BV-2细胞系和BMSC的来源及培养条件（DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素、37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials & Methods - Cell culture |
| 外泌体分离和表征 | ExoQuick-TC沉淀法步骤（离心速度和时间）及表征方法（TEM、NTA、Western blot） 阅读提示：Materials & Methods - Exosome isolation and Characterization |
| OGD模型及外泌体处理 | OGD条件（无糖DMEM、1% O2、4小时）和外泌体处理浓度（15 µg/mL） 阅读提示：Materials & Methods - Oxygen-glucose deprivation (OGD) modeling and exosome treatment |
| 流式细胞术检测 | 凋亡和表型检测抗体（CD40、CD86、CD206）及染色条件 阅读提示：Materials & Methods - Flow cytometry for apoptosis and cell phenotype |
| miRNA转染 | miRNA mimics/inhibitors及质粒的序列和转染条件（Lipofectamine 3000） 阅读提示：Materials & Methods - Cell transfection |
| 双荧光素酶报告基因测定 | psiCHECK-2-Traf6载体和突变体、共转染后检测时间 阅读提示：Materials & Methods - Dual luciferase reporter gene assay |