miRNA筛选与验证
鉴定RA相关差异表达miRNA，并筛选出BMSC-EVs中富集的候选miRNA。
利用GEO数据集GSE185059进行差异miRNA分析，结合EVmiRNA数据库和RT-qPCR验证，确定miR-378a-5p在RA滑膜组织中显著下调并在BMSC-EVs中富集。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
骨髓间充质干细胞释放携带miR-378a-5p的细胞外囊泡以减轻类风湿关节炎
Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Release miR-378a-5p-Carried Extracellular Vesicles to Alleviate Rheumatoid Arthritis.
实验完整度
高包含细胞模型（HSMECs）、体外功能实验（CCK-8、Transwell、管形成）、机制验证（双荧光素酶、RIP）及体内CIA小鼠模型验证。
主要模型
人滑膜微血管内皮细胞（HSMECs） 胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型 骨髓间充质干细胞（BMSCs）
重点核对
miR-378a-5p是否在BMSC-EVs中高表达且在RA滑膜组织中低表达 miR-378a-5p对IRF1的靶向结合及抑制效应 BMSC-EVs递送miR-378a-5p对HSMECs增殖、迁移和血管生成的影响 IRF1/STAT1轴在介导BMSC-EVs-miR-378a-5p效应中的作用 BMSC-EVs-miR-378a-5p在CIA小鼠中的治疗效果及对血管重塑的影响
摘要
本研究探讨骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的细胞外囊泡（EVs）是否可通过递送microRNA（miR）-378a-5p调控干扰素调节因子1/信号转导与转录激活因子1（IRF1/STAT1）轴来影响类风湿关节炎（RA）。我们使用GEO微阵列数据集GSE121894鉴定了RA相关miRNA。通过RT-qPCR发现了RA滑膜组织中最重要的miRNAs。BMSC来源的EVs经超速离心后与人滑膜微血管内皮细胞（HSMECs）体外共培养。双荧光素酶和RNA免疫沉淀研究检测了miR-378a-5p与IRF1的特异性结合。我们还使用CCK-8、Transwell和管形成实验测量了血管生成、迁移和增殖。通过诱导关节炎并评分建立胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型。RA滑膜组织中miR-378a-5p表达低，而BMSC来源的EVs中表达高。BMSC来源的EVs将miR-378a-5p转移至HSMECs后促进其增殖、迁移和血管生成。miR-378a-5p抑制IRF1。含miR-378a-5p的BMSC-EVs降低STAT1磷酸化和HSMEC IRF1表达。含miR-378a-5p模拟物的EVs促进HSMEC增殖、迁移和血管生成，而右美托咪定抑制STAT1磷酸化。在CIA小鼠中，含miR-378a-5p的BMSC-EVs增强滑膜血管重塑和组织病理学改善。因此，BMSC-EVs来源的miR-378a-5p促进HSMEC增殖、迁移和血管生成，使IRF1/STAT1轴失活，从而预防RA。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BMSC来源的细胞外囊泡是否通过递送miR-378a-5p调控IRF1/STAT1轴影响RA的血管生成和病理进展？
- 核心机制
- BMSC-EVs通过递送miR-378a-5p靶向抑制IRF1表达并降低STAT1磷酸化，使IRF1/STAT1轴失活，从而促进HSMEC增殖、迁移和血管生成，抑制RA进展。
- 主要证据
- 体外实验显示BMSC-EVs递送miR-378a-5p促进HSMEC增殖、迁移和管形成，且miR-378a-5p直接靶向并抑制IRF1；体内CIA小鼠模型中，BMSC-EVs-miR-378a-5p减轻关节炎评分、滑膜组织病理改变并促进血管重塑。
- 研究意义
- 研究为BMSC-EVs作为RA治疗策略提供了理论基础，并揭示了其通过miR-378a-5p/IRF1/STAT1轴发挥作用的机制，为RA的临床治疗及BMSCs和EVs在炎症性疾病中的应用提供实验依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BMSC-EVs的分离与鉴定
验证BMSC-EVs的纯度、形态及miR-378a-5p的富集情况。
通过超速离心法从BMSC培养基中分离EVs，使用TEM、NTA和Western blot进行鉴定，并检测miR-378a-5p表达。
BMSC-EVs递送miR-378a-5p至HSMECs及其功能验证
验证BMSC-EVs能否将miR-378a-5p递送至HSMECs并影响其增殖、迁移和血管生成。
将PKH67标记的EVs和Cy3-miR-378a-5p标记的EVs与HSMECs共培养，检测其摄取；用miR-378a-5p mimic或inhibitor处理BMSCs后提取EVs，与HSMECs共培养，检测HSMECs中miR-378a-5p水平、增殖（CCK-8）、迁移（Transwell）和管形成能力。
miR-378a-5p靶向IRF1的机制验证
验证miR-378a-5p是否直接靶向并抑制IRF1。
通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-378a-5p与IRF1 3'UTR的结合；通过RIP实验检测miR-378a-5p和IRF1在RISC复合物中的共存；通过RT-qPCR和Western blot检测过表达或敲低miR-378a-5p对IRF1表达的影响。
IRF1/STAT1轴的功能验证
验证miR-378a-5p通过抑制IRF1/STAT1轴促进HSMEC功能。
在用EVs-miR-378a-5p mimic处理HSMECs后，检测IRF1表达和STAT1磷酸化水平，并观察Dex（能增加STAT1磷酸化）处理对HSMEC增殖、迁移、管形成及相关蛋白表达的影响。
CIA小鼠模型的体内验证
验证BMSC-EVs-miR-378a-5p在体内对RA的治疗作用及机制。
通过牛II型胶原诱导CIA模型，腹腔注射EVs、EVs-miR-378a-5p mimic、Dex或联合处理，评估关节炎评分、爪厚度、疾病发生率、滑膜组织病理（H&E和TRAP染色）以及血管重塑指标（VEGFA、sFlt1、CD31）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Wuhan Procell Life Science and Technology Co., Ltd. | PM150210 |
| 胎牛血清 | Biowest | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Wuhan Procell Life Science and Technology Co., Ltd. | PB180120 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 骨髓间充质干细胞 | ATCC | PCS-500-012 | |
| 人滑膜微血管内皮细胞 | Cell Systems | ACBRI 488 | |
| EVs分离与鉴定 | Optima L-100XP超速离心机 | Beckman Coulter | -- |
| H7500透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| NanoSight NS300纳米颗粒跟踪分析仪 | Malvern Instruments Ltd. | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 |
| 脂质体2000转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | 540222 | |
| EVs摄取实验 | PKH67绿色荧光染料试剂盒 | Sigma-Aldrich | PKH67GL |
| 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Cy3标记的miR-378a-5p | Genechem | -- | |
| 激光共聚焦显微镜LSM710 | Zeiss | -- | |
| 细胞迁移实验 | Transwell小室 | Corning Glass Works | -- |
| 管形成实验 | 钙黄绿素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0038 |
| 双荧光素酶实验 | pRL-TK荧光素酶报告质粒 | Promega | -- |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| Ago2抗体 | Abcam | ab32381 | |
| IgG抗体 | Abcam | ab109489 | |
| CIA小鼠模型 | 牛II型胶原 | Sigma-Aldrich | 234184-M |
| 完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| ELISA | VEGF和sFlt1 ELISA试剂盒 | MSK Biotechnology | 69-50049 |
| 酶标仪Synergy 2 | BioTek | -- | |
| 组织染色 | TRAP染色 | Biolab | HR0561 |
| 免疫荧光 | CD31抗体 | Abcam | ab24590 |
| 山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488） | Thermo Fisher Scientific | A21235 | |
| DABCO抗淬灭剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 10296010CN |
| Prime Script逆转录试剂盒 | Beyotime | D7168M | |
| miRNA第一链cDNA合成（加尾反应）试剂盒 | Shanghai Sangon Biotech | B532451-0010 | |
| mirVana PARIS试剂盒 | Ambion | AM1556 | |
| SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | Invitrogen | 11794200 | |
| ABI StepOne实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| miRcute Plus miRNA qPCR检测试剂盒 | TIANGEN | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | C0481 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| IRF1抗体 | Abcam | ab186384 | |
| STAT1抗体 | Abcam | ab92506 | |
| p-STAT1抗体 | Abcam | ab109461 | |
| N-cadherin抗体 | Abcam | ab76011 | |
| Bcl-2抗体 | Abcam | ab32124 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| PCNA抗体 | Abcam | ab92552 | |
| YAP抗体 | Abcam | ab76252 | |
| VEGFA抗体 | Abcam | ab46154 | |
| E-cadherin抗体 | Abcam | ab40772 | |
| Bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 山羊抗兔IgG HRP标记二抗 | Abcam | ab205718 | |
| Pierce ECL底物 | Pierce | NCI4106 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BMSC和HSMEC的培养基组成（DMEM、FBS浓度、青霉素/链霉素浓度），细胞培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture |
| EVs分离与鉴定 | 超速离心参数（100,000 g，时间），EVs标志物（CD63、ALIX、CD9）及非标志物（GRP94、白蛋白）的检测结果 阅读提示：Materials and Methods - Extraction and Identification of EVs from BMSCs |
| 细胞转染 | miR-378a-5p mimic/inhibitor的浓度和转染试剂（Lipofectamine 3000/2000），处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods - In vitro Experimental Protocols |
| 体外功能实验 | CCK-8检测的细胞密度和孵育时间，Transwell迁移实验的细胞浓度和培养时间，管形成实验的细胞密度和观察时间 阅读提示：Materials and Methods - Transwell Assay for Cell Migration, Tube Formation Assay, CCK-8 Assay |
| CIA小鼠模型 | 小鼠品系（DBA/1）和年龄（8-12周），胶原诱导方法，EVs注射剂量（140 μg/mL, 0.5 mL/只/天，腹腔注射6天），Dex剂量（0.225 mg/kg/天，皮下注射6天），处理起始时间（第14天）及评估时间点（第21、27、36、42天） 阅读提示：Materials and Methods - Collagen-Induced Arthritis Mouse Model |