体外细胞活力检测
确定布洛芬对ATC细胞增殖的抑制作用
使用CCK8法检测不同浓度布洛芬处理C643和OCUT-2C细胞48小时后的细胞活力。
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布洛芬通过触发NLRP3-ASC-GSDMD依赖的焦亡在体内和体外抑制未分化甲状腺细胞
Ibuprofen inhibits anaplastic thyroid cells in vivo and in vitro by triggering NLRP3-ASC-GSDMD-dependent pyroptosis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK8、Transwell、划痕、流式、LDH、TEM、免疫荧光、Western blot、GSDMD过表达）和体内异种移植瘤模型，且进行功能验证和机制验证。
主要模型
C643人未分化甲状腺癌细胞系 OCUT-2C人未分化甲状腺癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型（OCUT-2C细胞）
重点核对
细胞系：C643和OCUT-2C 布洛芬浓度：C643为0.5、1、1.5 mM，OCUT-2C为1、2、3 mM 处理时间：48小时 动物模型：5周龄雌性BALB/c裸鼠，皮下注射2×10^6个OCUT-2C细胞 体内给药剂量：10或20 mg/kg布洛芬，灌胃，隔天一次
摘要
焦亡是一种新型的促炎性程序性细胞死亡，与炎症、免疫和癌症相关。未分化甲状腺癌（ATC）死亡率高，目前没有有效或标准的治疗方法。该病进展迅速，肿瘤可侵犯气管和食管，导致呼吸和吞咽困难。因此，迫切需要新的治疗方法。布洛芬是一种常见药物，可在某些癌症中发挥抗肿瘤作用。在本研究中，我们在体外和体内证明了布洛芬可以诱导ATC焦亡。因此，我们用布洛芬处理C643和OCUT-2C ATC细胞，发现一些垂死细胞呈现出焦亡的特征性形态学特征，如气泡样肿胀和膜破裂，并伴有ASC和NLRP3的激活以及GSDMD的裂解。随着LDH释放的增加，布洛芬处理促进了细胞凋亡，并抑制了细胞活力、侵袭和迁移。然而，GSDMD的过表达显著抑制了布洛芬诱导的焦亡。在体内，研究表明，布洛芬诱导的焦亡可以剂量依赖性地抑制裸鼠甲状腺肿瘤的生长。在这项研究中，我们探索了布洛芬抑制ATC生长和进展的新机制，并强调了其作为ATC治疗剂的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 布洛芬是否通过诱导焦亡来抑制未分化甲状腺癌（ATC）的生长和进展？
- 核心机制
- 布洛芬通过激活NLRP3-ASC-GSDMD通路，导致GSDMD裂解，诱导ATC细胞焦亡。
- 主要证据
- 体外实验显示布洛芬处理C643和OCUT-2C细胞后出现焦亡形态（TEM）、LDH释放增加、NLRP3和ASC表达上调、GSDMD裂解；GSDMD过表达逆转了这些效应。体内实验显示布洛芬剂量依赖性抑制裸鼠肿瘤生长，并上调NLRP3和ASC、下调GSDMD表达。
- 研究意义
- 该研究提供了布洛芬通过诱导焦亡治疗ATC的实验和理论基础，可能促进ATC治疗新策略的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞形态学观察
确定布洛芬诱导的细胞死亡类型是否为焦亡
使用透射电子显微镜（TEM）观察布洛芬处理后ATC细胞的形态变化。
功能学检测
评估布洛芬对ATC细胞侵袭、迁移和凋亡的影响
使用Transwell侵袭实验、划痕愈合实验和流式细胞术检测布洛芬处理后细胞的侵袭、迁移和凋亡率。
LDH释放检测
评估布洛芬对细胞膜完整性的影响
检测布洛芬处理后ATC细胞上清液中LDH的活性。
机制蛋白表达检测
验证布洛芬是否通过NLRP3-ASC-GSDMD通路诱导焦亡
使用Western blot和免疫荧光检测布洛芬处理后NLRP3、ASC和GSDMD的表达和定位。
GSDMD过表达实验
验证GSDMD在布洛芬诱导焦亡中的关键作用
通过慢病毒载体在ATC细胞中过表达GSDMD，然后检测布洛芬处理后细胞功能、LDH释放、凋亡和蛋白表达的变化。
体内异种移植瘤模型
验证布洛芬在体内对ATC肿瘤生长的抑制作用及机制
将OCUT-2C细胞皮下注射入BALB/c裸鼠，成瘤后给予不同浓度布洛芬治疗，监测肿瘤体积和重量，并通过IHC和HE检测蛋白表达和组织损伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Leagene Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 药物处理 | 布洛芬 | MedChemExpress | 15687-27-1 |
| CCK8实验 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| Transwell侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 膜联蛋白V | Jiangsu Keygen Biotech Corp, Ltd | -- |
| 碘化丙啶 | Jiangsu Keygen Biotech Corp, Ltd | -- | |
| 免疫荧光 | 抗ASC抗体 | Servicebio | GB115270 |
| 抗NLRP3抗体 | SAB | 29125 | |
| 抗GSDMD抗体 | Proteintech | 20770-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG (Dylight 488) | abbkine | A23220 | |
| 山羊抗兔IgG (Dylight 649) | abbkine | A23620 | |
| DAPI | Solarbio | S2110 | |
| OE-RNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Good here | AB-P-R001 | |
| 山羊抗兔IgG | Dingguo | IH-0011 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Servicebio | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系C643和OCUT-2C的来源和培养条件（培养基、血清浓度、双抗浓度、培养温度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 药物处理 | 布洛芬的纯度、溶解方法、处理浓度（C643: 0.5, 1, 1.5 mM; OCUT-2C: 1, 2, 3 mM）和处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture; Results: figure legends |
| 细胞活力检测 | CCK8实验的细胞接种密度（5×10^3/孔）、处理时间（48小时）、CCK8孵育时间（2小时）和检测波长（450nm） 阅读提示：Materials and methods: CCK8 assays |
| 侵袭和迁移实验 | Transwell实验的上室细胞数（1×10^4）、布洛芬浓度、处理时间（48小时）、划痕实验的细胞接种密度（4×10^5）和血清饥饿处理 阅读提示：Materials and methods: Transwell, Wound healing assay |
| 凋亡检测 | 流式细胞术的细胞染色（Annexin V-FITC和PI）、处理时间（48小时）和细胞收集步骤 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| LDH释放实验 | 细胞接种密度（30×10^4/孔）、处理时间（48小时）和LDH检测试剂盒的步骤 阅读提示：Materials and methods: LDH |
| 机制蛋白检测 | 抗体信息（抗ASC、抗NLRP3、抗GSDMD）及其稀释比例（文中未明确说明）、Western blot和免疫荧光的固定、通透化步骤 阅读提示：Materials and methods: Western blotting, Immunofluorescence |
| GSDMD过表达 | 过表达载体（OE-GSDMD）和对照载体的构建信息、转染试剂（Lipofectamine 3000）和转染后处理时间 阅读提示：Materials and methods: OE-RNA transfection |
| 体内实验 | 动物品系（BALB/c裸鼠）、年龄（5周）、性别（雌性）、细胞注射数量（2×10^6）、给药剂量（10和20 mg/kg）、给药频率（隔天一次）和给药途径（灌胃） 阅读提示：Materials and methods: Xenograft models |