PANoptosis相关基因在动脉粥样硬化发展中的作用:初步研究

A Pilot Study About the Role of PANoptosis-Based Genes in Atherosclerosis Development.

作者信息HongKui Chen, Xianwei Xie, Huazhen Xiao, Wenjia Liang, Zhi-Jie Lin, Biting Lin, Kai-Yang Lin, Chun Chen, Yansong Guo
PMID38149113
发布时间2023-12-22
DOI10.2147/JIR.S442260

实验完整度

包含生物信息学分析(差异表达、WGCNA、免疫浸润、单细胞)和体外细胞实验验证(ox-LDL处理、油红O染色、RT-qPCR),但缺少动物模型和蛋白水平验证。

主要模型

RAW264.7巨噬细胞系 GSE100927数据集(人动脉粥样硬化样本) GSE43292验证集 GSE159677单细胞数据集

重点核对

用于诊断标志物验证的细胞模型为RAW264.7巨噬细胞,以ox-LDL处理诱导泡沫细胞形成 ox-LDL浓度:100 μg/mL(油红O染色)或100 ng/mL(RT-qPCR),处理时间为48小时 基因表达检测使用RT-qPCR,以β-actin为内参,差异显著性用t检验,P<0.05为显著 诊断标志物鉴定结合GSE100927和GSE43292数据集,AUC>0.7为诊断标准 免疫浸润分析使用CIBERSORT,单细胞分析使用Seurat包

摘要

背景:作为一种慢性炎症性疾病,动脉粥样硬化(AS)和缺血事件主要受AS中的炎症影响。PANoptosis已被牵涉到许多人类全身性疾病中,包括感染、癌症、神经退行性疾病和炎症。另一方面,对PANoptosis在AS中的作用知之甚少。方法:我们使用一致性聚类将GSE100927数据集分为两个PANoptosis相关亚组。通过差异分析和加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选PANoptosis相关基因,并使用ClueGO软件进行富集。研究LASSO回归和MCODE以确定AS诊断标志物。使用免疫浸润分析和单细胞分析来寻找与诊断基因相关的细胞类型。最终通过聚合酶链反应(PCR)进行验证。结果:我们基于PANoptosis相关基因的表达,使用一致性聚类将GSE100927数据集分为两个PANoptosis相关亚型。在差异表达基因和WGCNA相关模块中共筛选出36个PANoptosis相关基因。通过MCODE和LASSO回归鉴定出4个hub基因,并通过外部验证集筛选出3个AS诊断标志物(ACP5、CCL3、HMOX1)。免疫浸润分析和单细胞分析显示这三个诊断标志物与巨噬细胞相关,PCR结果表明ACP5和HMOX1可作为AS诊断标志物。结论:我们的研究确定了ACP5和HMOX1可能是与PANoptosis相关的AS诊断基因。ACP5和HMOX1可能通过调节巨噬细胞PANoptosis参与AS的发病机制。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PANoptosis在动脉粥样硬化发展中的作用及其诊断标志物是什么?
核心机制
ACP5和HMOX1可能通过调节巨噬细胞PANoptosis参与动脉粥样硬化的发病机制,可能涉及NF-κB信号通路和坏死性凋亡等途径。
主要证据
通过生物信息学分析(差异表达、WGCNA、免疫浸润、单细胞)和体外细胞实验(ox-LDL处理RAW264.7,RT-qPCR验证)证实ACP5和HMOX1表达变化与AS相关。
研究意义
为动脉粥样硬化的诊断提供新的潜在标志物,并为理解PANoptosis在AS病理生理过程中的作用提供参考。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据收集与预处理

获取动脉粥样硬化相关基因表达数据,为后续分析提供基础。

从GEO数据库获取GSE100927(AS=69, control=35)、GSE43292(AS=32, control=32)和GSE159677(单细胞数据)微阵列数据,并收集66个PANoptosis相关基因。

2

差异表达分析

筛选动脉粥样硬化中差异表达的PANoptosis相关基因。

使用Limma R包对GSE100927数据集进行差异表达分析,筛选标准为|Log2FC|>0.6且adj.P<0.05,并绘制热图和火山图。

3

一致性聚类分析

根据PANoptosis基因表达将动脉粥样硬化样本分为不同亚型。

使用ConsensusClusterPlus软件进行一致性聚类,参数设置为80%样本和特征重采样、最大k=9、1000次重复、hclust算法和Pearson距离,最终确定k=2。

4

WGCNA共表达网络分析

识别与PANoptosis亚型相关的基因模块。

使用WGCNA包构建共表达网络,软阈值功率设为3,通过动态树切割方法将基因聚类为10个模块,筛选与PANoptosis亚型最相关的Turquoise模块(720个基因)。

5

特征基因筛选与功能富集

筛选与PANoptosis亚型相关的特征基因并进行功能注释。

将51个亚型差异表达基因与720个Turquoise模块基因取交集,获得36个特征基因(GS1);使用ClueGO进行GO富集分析,发现主要富集于中性粒细胞迁移等通路;使用MCODE和LASSO回归筛选hub基因,最终确定4个候选基因(ACP5, CCL3, CCL4, HMOX1)。

6

诊断效能评估

评估候选基因在动脉粥样硬化诊断中的准确性。

在GSE100927和GSE43292数据集中进行ROC曲线分析,以AUC>0.7作为诊断标准;最终确定ACP5、CCL3和HMOX1为诊断标志物。

7

免疫浸润与单细胞分析

探索诊断标志物与免疫细胞类型的关系。

使用CIBERSORT算法评估22种免疫细胞丰度,并分析诊断基因与免疫细胞的相关性;使用Seurat包对GSE159677单细胞数据进行整合分析,发现ACP5、HMOX1和CCL3主要表达于巨噬细胞。

8

体外实验验证

验证候选基因在细胞模型中的表达变化。

使用ox-LDL处理RAW264.7巨噬细胞诱导泡沫细胞形成,油红O染色观察泡沫化;RT-qPCR检测ACP5、HMOX1和CCL3的mRNA表达。结果显示ACP5和HMOX1表达升高,CCL3表达降低。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基----
胎牛血清----
青霉素----
链霉素----
L-谷氨酰胺----
氧化低密度脂蛋白YESEN20605ES05
油红O储备液SolarbioG1260
SteadyPure磁珠组织/细胞RNA提取试剂盒Accurate BiologyAG21023
Evo M-MLV反转录试剂盒(含gDNA清除)Accurate BiologyAG11728
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒Accurate BiologyAG11701

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
数据获取与预处理
GEO数据集编号:GSE100927(训练集)、GSE43292(验证集)、GSE159677(单细胞数据);PANoptosis基因列表来源
阅读提示:Materials and Methods: Data Gathering
差异表达分析
筛选阈值:|Log2FC|>0.6,adj.P<0.05
阅读提示:Materials and Methods: DEG Identification
一致性聚类
k值确定(k=2);聚类参数:80%重采样、1000次重复、hclust、Pearson距离
阅读提示:Materials and Methods: Analysis of Consensus Clustering
WGCNA
软阈值功率(设为3);模块筛选标准:|MM|≥0.7,|GS|≥0.7,p<0.01
阅读提示:Materials and Methods: Weighted Gene Co-Expression Network Analyses
诊断基因筛选
LASSO回归参数(alpha=1,binomial);AUC>0.7为标准
阅读提示:Materials and Methods: LASSO Model Selection Procedure Construction; ROC Curve Analysis
免疫浸润分析
CIBERSORT算法;p<0.05为可靠样本
阅读提示:Materials and Methods: Analysis of Immune Cell Invasion
单细胞分析
GSE159677数据集;整合细胞群数量(8个),表达分析
阅读提示:Materials and Methods: Single-Cell Analysis
细胞培养及处理
RAW264.7细胞系(Procell, CL-0190);培养条件:DMEM, 10% FBS, 100 units/mL 青霉素, 100 μg/mL 链霉素, 2mM L-谷氨酰胺;ox-LDL浓度:100 μg/mL(油红O)或100 ng/mL(RT-qPCR),时间48小时
阅读提示:Materials and Methods: Cell Culture; Assay for Foam Cell Generation; Quantitative RT-PCR
RT-qPCR验证
引物序列(β-actin, CCL3, ACP5, HMOX1);内参β-actin;统计检验:独立样本t检验,P<0.05为显著
阅读提示:Materials and Methods: Quantitative RT-PCR; Statistical Analysis