数据收集与预处理
获取动脉粥样硬化相关基因表达数据,为后续分析提供基础。
从GEO数据库获取GSE100927(AS=69, control=35)、GSE43292(AS=32, control=32)和GSE159677(单细胞数据)微阵列数据,并收集66个PANoptosis相关基因。
A Pilot Study About the Role of PANoptosis-Based Genes in Atherosclerosis Development.
包含生物信息学分析(差异表达、WGCNA、免疫浸润、单细胞)和体外细胞实验验证(ox-LDL处理、油红O染色、RT-qPCR),但缺少动物模型和蛋白水平验证。
RAW264.7巨噬细胞系 GSE100927数据集(人动脉粥样硬化样本) GSE43292验证集 GSE159677单细胞数据集
用于诊断标志物验证的细胞模型为RAW264.7巨噬细胞,以ox-LDL处理诱导泡沫细胞形成 ox-LDL浓度:100 μg/mL(油红O染色)或100 ng/mL(RT-qPCR),处理时间为48小时 基因表达检测使用RT-qPCR,以β-actin为内参,差异显著性用t检验,P<0.05为显著 诊断标志物鉴定结合GSE100927和GSE43292数据集,AUC>0.7为诊断标准 免疫浸润分析使用CIBERSORT,单细胞分析使用Seurat包
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取动脉粥样硬化相关基因表达数据,为后续分析提供基础。
从GEO数据库获取GSE100927(AS=69, control=35)、GSE43292(AS=32, control=32)和GSE159677(单细胞数据)微阵列数据,并收集66个PANoptosis相关基因。
筛选动脉粥样硬化中差异表达的PANoptosis相关基因。
使用Limma R包对GSE100927数据集进行差异表达分析,筛选标准为|Log2FC|>0.6且adj.P<0.05,并绘制热图和火山图。
根据PANoptosis基因表达将动脉粥样硬化样本分为不同亚型。
使用ConsensusClusterPlus软件进行一致性聚类,参数设置为80%样本和特征重采样、最大k=9、1000次重复、hclust算法和Pearson距离,最终确定k=2。
识别与PANoptosis亚型相关的基因模块。
使用WGCNA包构建共表达网络,软阈值功率设为3,通过动态树切割方法将基因聚类为10个模块,筛选与PANoptosis亚型最相关的Turquoise模块(720个基因)。
筛选与PANoptosis亚型相关的特征基因并进行功能注释。
将51个亚型差异表达基因与720个Turquoise模块基因取交集,获得36个特征基因(GS1);使用ClueGO进行GO富集分析,发现主要富集于中性粒细胞迁移等通路;使用MCODE和LASSO回归筛选hub基因,最终确定4个候选基因(ACP5, CCL3, CCL4, HMOX1)。
评估候选基因在动脉粥样硬化诊断中的准确性。
在GSE100927和GSE43292数据集中进行ROC曲线分析,以AUC>0.7作为诊断标准;最终确定ACP5、CCL3和HMOX1为诊断标志物。
探索诊断标志物与免疫细胞类型的关系。
使用CIBERSORT算法评估22种免疫细胞丰度,并分析诊断基因与免疫细胞的相关性;使用Seurat包对GSE159677单细胞数据进行整合分析,发现ACP5、HMOX1和CCL3主要表达于巨噬细胞。
验证候选基因在细胞模型中的表达变化。
使用ox-LDL处理RAW264.7巨噬细胞诱导泡沫细胞形成,油红O染色观察泡沫化;RT-qPCR检测ACP5、HMOX1和CCL3的mRNA表达。结果显示ACP5和HMOX1表达升高,CCL3表达降低。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 泡沫细胞生成 | 氧化低密度脂蛋白 | YESEN | 20605ES05 |
| 油红O储备液 | Solarbio | G1260 | |
| RT-qPCR | SteadyPure磁珠组织/细胞RNA提取试剂盒 | Accurate Biology | AG21023 |
| Evo M-MLV反转录试剂盒(含gDNA清除) | Accurate Biology | AG11728 | |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取与预处理 | GEO数据集编号:GSE100927(训练集)、GSE43292(验证集)、GSE159677(单细胞数据);PANoptosis基因列表来源 阅读提示:Materials and Methods: Data Gathering |
| 差异表达分析 | 筛选阈值:|Log2FC|>0.6,adj.P<0.05 阅读提示:Materials and Methods: DEG Identification |
| 一致性聚类 | k值确定(k=2);聚类参数:80%重采样、1000次重复、hclust、Pearson距离 阅读提示:Materials and Methods: Analysis of Consensus Clustering |
| WGCNA | 软阈值功率(设为3);模块筛选标准:|MM|≥0.7,|GS|≥0.7,p<0.01 阅读提示:Materials and Methods: Weighted Gene Co-Expression Network Analyses |
| 诊断基因筛选 | LASSO回归参数(alpha=1,binomial);AUC>0.7为标准 阅读提示:Materials and Methods: LASSO Model Selection Procedure Construction; ROC Curve Analysis |
| 免疫浸润分析 | CIBERSORT算法;p<0.05为可靠样本 阅读提示:Materials and Methods: Analysis of Immune Cell Invasion |
| 单细胞分析 | GSE159677数据集;整合细胞群数量(8个),表达分析 阅读提示:Materials and Methods: Single-Cell Analysis |
| 细胞培养及处理 | RAW264.7细胞系(Procell, CL-0190);培养条件:DMEM, 10% FBS, 100 units/mL 青霉素, 100 μg/mL 链霉素, 2mM L-谷氨酰胺;ox-LDL浓度:100 μg/mL(油红O)或100 ng/mL(RT-qPCR),时间48小时 阅读提示:Materials and Methods: Cell Culture; Assay for Foam Cell Generation; Quantitative RT-PCR |
| RT-qPCR验证 | 引物序列(β-actin, CCL3, ACP5, HMOX1);内参β-actin;统计检验:独立样本t检验,P<0.05为显著 阅读提示:Materials and Methods: Quantitative RT-PCR; Statistical Analysis |