构建ECM工程化异种移植模型
在体内验证ECM蛋白（胶原、FN）对黑色素瘤生长和VM形成的影响
将B16F10细胞分别悬浮于PBS、50 mg/mL胶原溶液、50 mg/mL FN溶液及50 mg/mL胶原/FN混合溶液中，皮下注射至ICR小鼠右侧胁腹，于第12天处死，取出肿瘤，称重，进行IHC、H&E及CD31/PAS染色。
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工程化体内外肿瘤模型重现黑色素瘤的血管生成拟态特征
Engineered in vivo and in vitro tumor model recapitulates vasculogenic mimicry signatures in melanoma.
实验完整度
高包含体内异种移植模型（CD31‐PAS双染）和体外细胞实验（CCK‐8、克隆形成、迁移、侵袭、管形成）以及机制验证（qPCR、免疫荧光）。
主要模型
B16F10小鼠黑色素瘤细胞 ECM工程化异种移植小鼠模型 Matrigel三维管形成模型
重点核对
B16F10细胞与PBS/胶原/FN/胶原-FN混合液皮下注射于ICR小鼠右侧胁腹，剂量1×10^6 cells/150 μL，蛋白浓度50 mg/mL 体外基质包被浓度5 μg/mL CCK-8检测时间24小时 管形成实验细胞数2×10^4，在Matrigel上孵育12小时
摘要
血管生成拟态（VM）描述了肿瘤细胞以无内皮细胞方式形成新型微循环模式的过程。临床上，VM与侵袭性表型和患者生存期差相关。然而，目前研究VM的模型包括二维单层培养、基于Matrigel的培养和动物模型，每种都有局限性。基于Matrigel的模型常表现出批次间差异，而目前的体内肿瘤模型产生的VM量不足。目前没有合适的肿瘤模型来发现针对VM的新治疗靶点。在此，我们建立了基于细胞外基质（ECM）的工程化体内和体外肿瘤模型。在本研究中，我们证明了基质蛋白增强了工程化异种移植模型中的VM形成。此外，我们还研究了胶原蛋白/纤连蛋白（FN）在黑色素瘤进展和VM形成中的作用。与在TCPS板上培养的细胞相比，在胶原蛋白/FN包被的板上培养的B16F10细胞表现出增殖和干性增加，以及侵袭和VM网络形成显著增强。分子机制分析表明，Integrin/VE‐cadherin/EphA2/PI3K/MMP‐2信号通路负责VM形成。我们的结果表明，胶原蛋白/FN基质在黑色素瘤VM形成中起重要作用，提示ECM蛋白是黑色素瘤抗VM治疗的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胶原蛋白和纤连蛋白（FN）作为细胞外基质（ECM）成分，在黑色素瘤血管生成拟态（VM）形成中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- 胶原蛋白和FN通过激活Integrin/VE‐cadherin/EphA2/PI3K轴，进而上调MMP‐2并诱导EMT相关Vimentin表达，促进黑色素瘤VM形成。
- 主要证据
- 体内异种移植模型显示ECM蛋白处理显著增加肿瘤生长和VM数量（CD31‐PAS双染）；体外B16F10细胞在胶原/FN包被板上增殖、干性、迁移、侵袭和管形成增强，qPCR显示Integrin、VE‐cadherin、EphA2、PI3K、Vimentin表达上调。
- 研究意义
- 该ECM工程化体内外肿瘤模型可作为抗肿瘤和抗VM药物筛选及评估平台，并为ECM-VM微环境的全面理解提供机会；靶向胶原/FN可能抑制黑色素瘤VM并降低抗血管生成治疗抵抗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证体内VM和微血管形成
区分VM血管与内皮依赖性血管，并评估ECM蛋白对VM形成的影响
对肿瘤组织进行CD31‐PAS双染色，PAS阳性且CD31阴性的血管计为VM；PAS阴性且CD31阳性的血管为内皮血管。同时进行H&E染色分析微血管形成。
体外研究ECM基质对细胞增殖和干性的影响
评估胶原/FN基质对B16F10细胞增殖和集落形成能力的影响
将B16F10细胞接种于包被PBS、胶原、FN及胶原/FN（5 μg/mL）的TCPS板上，通过CCK‐8试剂盒检测细胞增殖，通过结晶紫染色进行集落形成分析（培养10天），并通过Ki‐67免疫荧光染色评估增殖。
体外评估细胞迁移和侵袭
测定ECM基质对B16F10细胞迁移和侵袭能力的影响
采用划痕实验和transwell实验检测迁移和侵袭。划痕实验中，细胞培养至95%融合，用200 μL移液器枪头划痕，加入含丝裂霉素C的完全培养基，在0、24、48小时观察。Transwell实验中，5×10^4细胞重悬于含ECM蛋白的溶液，加入上室，下室加含10% FBS的培养基，培养24小时后固定染色计数。
体外管形成实验检测VM形成
评估ECM基质对黑色素瘤细胞形成VM网络能力的影响
将Matrigel铺于48孔板底部，培养1小时，然后将B16F10细胞重悬于不同条件培养基（含5 μg/mL胶原、FN或胶原/FN），接种到Matrigel上，培养12小时，利用倒置显微镜拍照，并用Calcein‐AM染色进行荧光显像，计数管状结构。
分子机制分析
探讨ECM基质调控VM形成的信号通路
通过RT‐qPCR检测Integrin、VE‐cadherin、EphA2、PI3K和Vimentin的mRNA表达；通过免疫荧光染色检测Integrin β3、Vimentin和Ki‐67的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 制备ECM基质 | I型胶原蛋白 | Solarbio | -- |
| 纤连蛋白 | Solarbio | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 组织培养处理板 | Conning | -- | |
| 细胞培养 | B16F10细胞系 | Procell Life Science & Technology | -- |
| 1640完全培养基 | Gibco | -- | |
| 胰酶-EDTA溶液（0.25%） | Solarbio | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Solarbio | -- |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 集落形成实验 | 结晶紫溶液 | Solarbio | -- |
| 细胞迁移实验 | 倒置显微镜 | Nikon | -- |
| Trans-well小室 | Conning | -- | |
| VM形成实验 | Matrigel基质胶 | -- | -- |
| 钙黄绿素-AM | -- | -- | |
| RT-qPCR分析 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Vazyme试剂 | Vazyme | -- | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠Integrin β3抗体 | Abmart | -- |
| 兔Vimentin抗体 | CST | -- | |
| 兔Ki-67抗体 | Bioss | -- | |
| Dylight 550偶联二抗 | Boster | -- | |
| FITC-鬼笔环肽 | Solarbio | -- | |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | -- | |
| IHC | 抗Ki67抗体 | -- | -- |
| 抗Integrin β3抗体 | -- | -- | |
| 抗VE-钙粘蛋白抗体 | -- | -- | |
| 抗Vimentin抗体 | -- | -- | |
| 抗MMP-2抗体 | -- | -- | |
| CD31-PAS双染色 | 抗CD31抗体 | -- | -- |
| 动物实验 | ICR小鼠 | Laboratory Animal Center of Shanxi Medical University | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 制备ECM基质 | 胶原I和FN浓度均为5 μg/mL；PBS溶解；包被TCPS板；37°C孵育2小时；PBS洗三次。 阅读提示：Methods 2.1 |
| 细胞培养 | B16F10细胞在含1640完全培养基的75 cm²培养瓶中，5% CO2、37°C培养，每2天换液，80%融合时用0.25%胰酶-EDTA传代。 阅读提示：Methods 2.2 |
| 动物实验 | ICR雌性小鼠5周龄；细胞1×10^6悬浮于150 μL溶液（PBS、50 mg/mL胶原、50 mg/mL FN、50 mg/mL胶原/FN）；皮下注射右侧胁腹；第12天处死。 阅读提示：Methods 2.3 |
| 细胞增殖检测 | B16F10细胞以5×10^3/孔接种于96孔TCPS板（包被5 μg/mL ECM蛋白），培养24小时后加入CCK-8试剂再孵育3小时，450 nm测吸光度。 阅读提示：Methods 2.5 |
| 管形成实验 | Matrigel铺板在37°C孵育1小时；每孔接种2×10^4 B16F10细胞，重悬于含5 μg/mL ECM蛋白的无血清培养基；培养12小时；Calcein-AM染色10分钟。 阅读提示：Methods 2.8 |
| 分子机制分析（qPCR） | B16F10细胞在含有不同基质（5 μg/mL）的TCPS板上培养48小时；RNA提取用TRIzol；qPCR使用ChamQ SYBR Master Mix；以β-actin为内参。 阅读提示：Methods 2.9 |