临床样本及细胞系中JAK1/2-STAT3通路激活检测
验证JAK1/2-STAT3通路在ATC中是否过度激活。
通过IHC检测ATC、PTC和NT组织中的JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达；通过Western blot检测多种甲状腺细胞系中该通路的表达。
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芦可替尼通过转录抑制DRP1介导的线粒体分裂诱导未分化甲状腺癌凋亡和焦亡
Ruxolitinib induces apoptosis and pyroptosis of anaplastic thyroid cancer via the transcriptional inhibition of DRP1-mediated mitochondrial fission.
实验完整度
高研究包含临床样本分析、体外细胞实验、机制研究及体内异种移植模型，并进行了功能验证（敲除、过表达）和机制验证（双荧光素酶报告基因）。
主要模型
ATC细胞系（8505C、KHM-5M） BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 ATC患者肿瘤组织
重点核对
Ruxo浓度：0-180 μM处理24小时 DRP1过表达质粒转染48小时 siRNA敲低STAT3后检测DRP1表达 异种移植模型中Ruxo剂量：15 mg/kg和30 mg/kg腹腔注射 CRISPR/Cas9敲除GSDME、caspase 3、caspase 9
摘要
未分化甲状腺癌（ATC）的疾病特异性死亡率为100%。JAK1/2-STAT3通路是治疗血液和实体肿瘤的有前景的靶点。然而，JAK1/2-STAT3通路在ATC中是否被激活尚不清楚，其抑制剂芦可替尼（Ruxo，一种临床JAK1/2抑制剂）的抗癌作用和作用机制仍然难以捉摸。我们的数据表明，JAK1/2-STAT3信号通路在ATC肿瘤组织中的表达显著高于正常甲状腺和甲状腺乳头状癌组织。在体外和体内给予Ruxo后，ATC细胞中观察到凋亡和GSDME焦亡。机制上，Ruxo抑制STAT3的磷酸化，导致DRP1反式激活的抑制，并引起线粒体分裂缺陷。这种缺陷对于激活ATC细胞内caspase 9/3依赖性凋亡和GSDME介导的焦亡至关重要。总之，我们的发现表明DRP1受STAT3的直接调控和反式激活；这揭示了JAK1/2-STAT3在调节线粒体动力学方面的一个新颖而关键的方面。在ATC中，Ruxo对DRP1的转录抑制阻碍了线粒体分裂，并通过caspase 9/3依赖性机制触发凋亡和GSDME焦亡。这些结果为Ruxo治疗ATC的潜在疗效提供了令人信服的证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究JAK1/2-STAT3通路在ATC中的激活状态，以及Ruxo的抗癌作用及其机制。
- 核心机制
- Ruxo通过抑制STAT3磷酸化，下调DRP1的转录表达，导致线粒体分裂缺陷，进而激活caspase 9/3依赖性凋亡和GSDME介导的焦亡。
- 主要证据
- 体外实验显示Ruxo抑制ATC细胞活力、克隆形成、迁移和侵袭，诱导凋亡和GSDME焦亡；体内实验显示Ruxo抑制裸鼠异种移植肿瘤生长，且IHC显示c-caspase 3和c-PARP增加，DRP1降低；双荧光素酶报告基因证实STAT3直接结合DRP1启动子。
- 研究意义
- 作者提出Ruxo是治疗ATC的潜在治疗药物，并揭示JAK1/2-STAT3直接调控线粒体动力学的新机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Ruxo体外抗肿瘤活性评估
评估Ruxo对ATC细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。
使用CCK-8检测细胞活力，克隆形成实验、Transwell实验评估迁移和侵袭能力。
Ruxo诱导细胞死亡模式鉴定
确定Ruxo诱导的细胞死亡是否涉及凋亡和焦亡。
通过流式细胞术检测Annexin V/PI染色，观察细胞形态，检测LDH释放和GSDME、PARP剪切。
验证caspase 9/3-GSDME依赖性
确认Ruxo诱导的焦亡依赖于caspase 9/3和GSDME。
使用CRISPR/Cas9敲除GSDME、caspase 9、caspase 3，以及使用Z-VAD-FMK抑制剂，检测细胞死亡和LDH释放。
线粒体功能检测
评估Ruxo是否引起线粒体功能障碍。
检测Bcl-2/Bax比例、线粒体膜电位（JC-1）、ROS水平、Cyto C释放。
线粒体形态观察
观察Ruxo处理后线粒体形态变化。
使用Mito tracker、HSP60免疫荧光和透射电镜观察线粒体形态。
DRP1表达及STAT3调控机制验证
验证Ruxo通过STAT3调控DRP1转录。
检测DRP1 mRNA和蛋白水平，siRNA敲低STAT3，双荧光素酶报告基因检测STAT3结合DRP1启动子。
DRP1过表达和抑制对细胞死亡的影响
验证DRP1在Ruxo诱导细胞死亡中的关键作用。
在ATC细胞中过表达DRP1，或使用Mdivi-1抑制DRP1，检测细胞活力、凋亡和焦亡。
体内异种移植模型评估
评估Ruxo在体内的抗肿瘤效果和安全性。
将8505C细胞皮下接种BALB/c裸鼠，腹腔注射Ruxo和/或Mdivi-1，测量肿瘤体积和体重，进行HE和IHC染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 芦可替尼 | TargetMol | T1829 |
| Mdivi-1 | TargetMol | T1907 | |
| STX-0119 | TargetMol | T60160 | |
| 药物溶剂 | 吐温80 | TargetMol | T13947 |
| PEG300 | TargetMol | T7022 | |
| 细胞染色 | DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 |
| 细胞处理 | Z-VAD-FMK | Apex Bio | A1902 |
| 线粒体染色 | MitoTracker深红 | Cell Signaling Technology | 8778 |
| 免疫荧光 | 抗细胞色素C抗体 | BD Biosciences | 556432 |
| 抗HSP60抗体 | Proteintech | 66041-1-Ig | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | SERANA | S-FBS-SA-015 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Vazyme Biotech | A311-01 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Liankebio | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1 | Yeasen Biotechnology | 40705ES03 |
| 活性氧检测 | DCFH-DA | TargetMol | T15458 |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000015 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR037 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013 |
| PMSF | Beyotime Biotechnology | ST505 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | ECL试剂盒 | Fdbio Science | FD8020 |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Beyotime Biotechnology | A0208 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Beyotime Biotechnology | A0216 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | Beyotime Biotechnology | A0423 |
| Alexa Fluor 555标记的驴抗小鼠IgG | Beyotime Biotechnology | A0460 | |
| 双荧光素酶报告基因 | Dual-Lumi双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | RG088S |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning Costar | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 透射电镜 | 电镜固定液 | HaoKe Biotechnology | -- |
| 透射电子显微镜 | HITACHI | HT7650 | |
| 流式细胞术 | NovoCyte Quanteon台式流式细胞仪 | -- | -- |
| 荧光显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | STED |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS | |
| 细胞活力检测 | Synergy LX多功能酶标仪 | BioTek Instruments | -- |
| Western blot | ChemiDoc-MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Shanghai SLAC Animal Co. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件（培养基、血清浓度、抗生素） 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell culture |
| 药物处理 | Ruxo浓度、处理时间、溶剂（DMSO浓度） 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell viability 和 Results 中相应图注 |
| 细胞死亡检测 | Annexin V/PI染色步骤、流式细胞仪设置 阅读提示：Materials and methods 中的 Determination of cell survival rate |
| 线粒体功能检测 | JC-1浓度和处理时间、ROS探针浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods 中的 JC-1 functional assay 和 Intracellular ROS determination |
| 基因敲除/敲低 | siRNA序列、转染试剂和浓度、CRISPR sgRNA序列、MOI和嘌呤霉素筛选浓度 阅读提示：Materials and methods 中的 siRNA transfection and CRISPR/Cas9 knock-out cell lines |
| 蛋白检测 | 抗体稀释比例（Western blot） 阅读提示：Materials and methods 中的 Western blotting and antibodies |
| 动物实验 | 细胞接种数量、给药剂量和方式、给药周期、分组样本量 阅读提示：Materials and methods 中的 Xenograft tumor model 和 Results 中的 Ruxo inhibits the growth of mice xenografts in vivo |