临床样本中circ-Gatad1表达验证
验证circ-Gatad1在脓毒症AKI患者中的表达变化。
收集20例脓毒症AKI患者和20例健康对照的血清样本，提取RNA进行高通量测序和RT-qPCR检测circ-Gatad1表达。
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敲低circ-Gatad1通过靶向miR-22-3p/TRPM7轴减轻脓毒症急性肾损伤中LPS诱导的HK2细胞损伤
Knockdown of circ-Gatad1 alleviates LPS induced HK2 cell injury via targeting miR-22-3p/TRPM7 axis in septic acute kidney.
实验完整度
中包含临床样本表达分析、细胞模型功能验证、双荧光素酶报告及回补实验，但缺乏动物模型和体内验证。
主要模型
HK2人肾小管上皮细胞 脓毒症AKI患者血清样本
重点核对
LPS处理浓度5 μg/mL，处理时间12 h si-circ-Gatad1转染效率 miR-22-3p inhibitor和TRPM7过表达质粒的转染效率 LPS诱导后circ-Gatad1表达上调，呈剂量依赖性 CCK-8、流式凋亡、ROS和ELISA检测
摘要
脓毒症是一种危及生命的全身性炎症性疾病，可导致包括脓毒症急性肾损伤（AKI）在内的多种疾病。近年来，多种环状RNA（circRNA）已被涉及该疾病的发展。在本研究中，我们旨在阐明circ-Gatad1在脓毒症诱导的AKI中的作用及其潜在的作用机制。采用高通量测序研究AKI患者和健康志愿者中circRNA的异常表达。采用生物信息学分析和荧光素酶报告分析阐明circRNA、miRNA和mRNA之间的相互作用关系。用脂多糖（LPS）处理HK2细胞建立脓毒症AKI细胞模型。采用HK2细胞分析LPS条件下ROS、炎症细胞因子表达、增殖和凋亡。结果显示，circ-Gatad1在脓毒症急性肾损伤患者中表达升高。下调circ-Gatad1抑制了LPS处理的HK2细胞损伤，包括凋亡、增殖能力、ROS和炎症细胞因子水平。生物信息学和荧光素酶报告分析证实miR-22-3p和TRPM7均为circ-Gatad1的下游靶标。过表达TRPM7或下调miR-22-3p逆转了si-circ-Gatad1对暴露于LPS（5 µg/ml）微环境后HK2的保护作用。总之，敲低circ-Gatad1通过靶向miR-22-3p/TRPM7轴减轻脓毒症急性肾损伤中LPS诱导的HK2细胞损伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circ-Gatad1在脓毒症急性肾损伤中的作用及其潜在机制。
- 核心机制
- circ-Gatad1通过海绵吸附miR-22-3p上调TRPM7表达，从而促进LPS诱导的HK2细胞损伤。
- 主要证据
- 临床样本表达分析显示circ-Gatad1升高；LPS诱导的HK2细胞模型中，敲低circ-Gatad1减轻损伤；双荧光素酶报告验证circ-Gatad1-miR-22-3p-TRPM7调控轴；回补实验证实miR-22-3p/TRPM7介导保护作用。
- 研究意义
- 作者提出circ-Gatad1敲低可能是缓解脓毒症诱导AKI的潜在途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LPS诱导的HK2细胞脓毒症AKI模型建立及circ-Gatad1表达分析
建立体外脓毒症AKI模型并检测circ-Gatad1表达。
用不同浓度LPS（0-15 μg/mL）处理HK2细胞24小时，选择5 μg/mL LPS处理12小时建立模型，随后检测circ-Gatad1表达、定位和稳定性。
敲低circ-Gatad1的功能验证
验证敲低circ-Gatad1对LPS诱导的HK2细胞损伤的影响。
用si-circ-Gatad1转染HK2细胞，在LPS处理下检测细胞增殖、凋亡、ROS水平和炎症因子表达。
机制验证circ-Gatad1/miR-22-3p/TRPM7轴
验证circ-Gatad1、miR-22-3p和TRPM7之间的靶向关系。
利用生物信息学预测和双荧光素酶报告实验验证circ-Gatad1与miR-22-3p、miR-22-3p与TRPM7的结合，并通过RT-qPCR检测表达变化。
回补实验验证miR-22-3p/TRPM7介导保护作用
验证miR-22-3p/TRPM7是否为circ-Gatad1敲低保护作用的关键下游。
在敲低circ-Gatad1的HK2细胞中同时抑制miR-22-3p或过表达TRPM7，在LPS处理下检测增殖、凋亡、ROS和炎症因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA-seq文库构建 | VAHTS Total RNA-seq (H/M/R) 文库制备试剂盒 | Vazyme Biotech | -- |
| KAPA链特异性RNA-seq文库制备试剂盒 | Roche | -- | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | -- | |
| 细胞造模 | 脂多糖 | Solarbio | -- |
| 细胞转染 | pcDNA3.1载体 | -- | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | -- |
| ELISA | TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒 | Beyotime | -- |
| cDNA合成 | TransScript All-in-One第一链cDNA合成SuperMix | Transgen Biotech | -- |
| PCR | 2× Taq PCR Master Mix | Solarbio | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | pMIR-REPORT荧光素酶报告载体 | Ambion | -- |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- | |
| ROS检测 | 二氢乙啶（DHE）检测 | Beyotime | -- |
| 荧光检测 | 荧光酶标仪 | PerkinElmer | -- |
| 吸收光检测 | 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PCR | Bio-Rad PCR仪 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 血清样本来源：20例脓毒症AKI患者和20例健康对照；采集时患者空腹状态；样本保存条件-80°C 阅读提示：见Materials and methods中Serum samples部分 |
| 细胞模型建立 | HK2细胞培养条件（MEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，37°C、5%CO2）；LPS处理浓度5 μg/mL，处理时间12小时 阅读提示：见Materials and methods中Cell culture, LPS induction and cell transfection部分 |
| 基因敲低与过表达 | si-circ-Gatad1、miR-22-3p inhibitor和TRPM7过表达载体的转染方法（Lipofectamine 2000） 阅读提示：见Materials and methods中Cell culture, LPS induction and cell transfection部分 |
| 功能检测 | CCK-8实验细胞密度（1×10^4细胞/孔）和检测时间；ELISA检测的炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）；ROS检测使用DHE染色 阅读提示：见Materials and methods中CCK-8 assay、ELISA、ROS activity部分 |
| 机制验证 | 双荧光素酶报告实验中报告载体构建和共转染条件（miR-22-3p mimic或NC，转染后48小时检测） 阅读提示：见Materials and methods中Dual-luciferase reporter assay部分 |