建立TP诱导的体内生殖毒性模型
验证TP能否诱导大鼠卵巢损伤和氧化应激
成年雌性SD大鼠随机分为6组(n=5),TP组连续灌胃400 μg/kg/d TP(含5% DMSO的盐水)30天,对照组给予等量盐水,随后不同组分别给予XJCRTSZW(高、中、低剂量)或EV处理两周。
XinJiaCongRongTuSiZiWan protects triptolide-induced rats from oxidative stress injury via mitophagy mediated PINK1/Parkin signaling pathway.
含体内动物模型(SD大鼠)和体外细胞模型(人卵巢颗粒细胞系),并进行了病理、氧化应激指标、线粒体自噬及PINK1/Parkin通路的验证,且使用si-Pink1和ov-Pink1进行机制干预。
成年雌性SD大鼠 人卵巢颗粒细胞系(CP-H192)
TP剂量400 μg/kg/d灌胃30天诱导生殖毒性 XJCRTSZW剂量分别为30、15、7.5 g/kg/d灌胃两周 体外实验TP浓度100 nM处理6小时,XJCRTSZW含药血清200 μL处理48小时 Pink1 inhibitor 20 nM和Pink1 mimics 2 μg处理细胞
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TP能否诱导大鼠卵巢损伤和氧化应激
成年雌性SD大鼠随机分为6组(n=5),TP组连续灌胃400 μg/kg/d TP(含5% DMSO的盐水)30天,对照组给予等量盐水,随后不同组分别给予XJCRTSZW(高、中、低剂量)或EV处理两周。
评估XJCRTSZW对TP诱导的卵巢病理损伤和内分泌紊乱的改善作用
卵巢组织进行H&E染色,计数初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡;ELISA检测血清E2、AMH、FSH、LH水平。
评估XJCRTSZW对TP诱导的氧化应激水平的影响
检测GC中SOD、MDA、ROS水平。
评估XJCRTSZW对TP诱导的颗粒细胞凋亡的影响
GC用Annexin V-APC和PI染色,流式细胞术分析凋亡率。
评估XJCRTSZW对TP诱导的线粒体损伤和自噬的影响
透射电镜观察线粒体形态和自噬体;ELISA检测ATP;JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP);RT-qPCR和Western blot检测LC3、p62、Hsp60、PINK1和Parkin的表达。
在体外验证XJCRTSZW对TP诱导的颗粒细胞损伤的保护作用及PINK1的作用
人卵巢颗粒细胞系分为8组,TP处理6小时,然后加入含药血清、Pink1抑制剂或模拟物处理48小时;检测细胞活力、激素分泌、氧化应激、凋亡、线粒体自噬和PINK1/Parkin通路蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | Sprague-Dawley大鼠 | Chengdu Dashuo Biological Technology Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | 人卵巢颗粒细胞系 | Procell | CP-H192 |
| 人卵巢颗粒细胞完全培养基 | Procell | CM-H192 | |
| 细胞转染 | RiboFect™ CP转染试剂盒 | Ribobio | C10511-05 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| 酶联免疫吸附测定 | 雌二醇ELISA试剂盒 | Beyotime | PE223 |
| 大鼠AMH ELISA试剂盒 | Ybscience | YB-AMH-Ra | |
| 大鼠FSH ELISA试剂盒 | Ybscience | XY-FSH-Ra | |
| 大鼠LH ELISA试剂盒 | Ybscience | XY-LH-Ra | |
| 大鼠孕酮ELISA试剂盒 | Kemin Biology | KB3091 | |
| 大鼠ATP ELISA试剂盒 | Qingqi Biology | -- | |
| 氧化应激检测 | 脂质过氧化MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M |
| 总超氧化物歧化酶检测试剂盒(NBT法) | Beyotime | S0109 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC | Sigma Aldrich | -- |
| 碘化丙啶 | Sigma Aldrich | -- | |
| 流式细胞仪 | BD FACSVerse | -- | |
| 活性氧检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | Molecular Probes | -- |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 710 META | |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | JEM-1400PLUS | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| Bio-Rad Scrip™ cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- | |
| SYBR主混合物 | MedChemexpress | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | Solarbio | BC3711 |
| 蛋白测定试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 山羊抗兔IgG(H+L)-HRP | Abcam | ab6721 | |
| 电化学发光试剂盒 | EMD Millipore | WBULS0500 | |
| 兔抗LC3II/I抗体 | Abcam | ab128025 | |
| 兔抗p62抗体 | Abcam | ab56416 | |
| 兔多克隆PINK1抗体 | Abcam | ab23707 | |
| 兔多克隆Parkin抗体 | Abcam | ab15494 | |
| 兔多克隆Hsp60抗体 | Abcam | ab46798 | |
| 兔抗β-actin抗体 | Abcam | ab8227 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物分组与给药 | 大鼠品系、年龄、体重;TP溶剂和剂量;XJCRTSZW剂量和给药时间;EV给药方案;对照组处理 阅读提示:Methods: Experimental groups and drug administration |
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源和编号;培养基;TP浓度和处理时间;含药血清体积;Pink1抑制剂和mimics浓度 阅读提示:Methods: Cell culture, Cell transfection, Experimental groups and drug administration |
| 氧化应激检测 | SOD、MDA检测试剂盒型号;ROS检测试剂盒和流式细胞仪设置 阅读提示:Methods: Biochemical detection, Flow cytometric assay |
| 线粒体自噬评估 | 透射电镜固定和染色步骤;JC-1染色浓度和孵育时间;ATP和MMP检测方法 阅读提示:Methods: JC-1 staining, Transmission electron microscopy |
| 蛋白和mRNA表达 | Western blot抗体和稀释比例;RT-qPCR引物和内参 阅读提示:Methods: Western blot assay, Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction |