新加苁蓉菟丝子丸通过线粒体自噬介导的PINK1/Parkin信号通路保护雷公藤甲素诱导的大鼠免受氧化应激损伤

XinJiaCongRongTuSiZiWan protects triptolide-induced rats from oxidative stress injury via mitophagy mediated PINK1/Parkin signaling pathway.

作者信息Yan Jin, Deng Di-Si, Wu Ke-Ming
PMID38511762
发布时间2024-03-15
DOI10.1590/acb391424

实验完整度

含体内动物模型(SD大鼠)和体外细胞模型(人卵巢颗粒细胞系),并进行了病理、氧化应激指标、线粒体自噬及PINK1/Parkin通路的验证,且使用si-Pink1和ov-Pink1进行机制干预。

主要模型

成年雌性SD大鼠 人卵巢颗粒细胞系(CP-H192)

重点核对

TP剂量400 μg/kg/d灌胃30天诱导生殖毒性 XJCRTSZW剂量分别为30、15、7.5 g/kg/d灌胃两周 体外实验TP浓度100 nM处理6小时,XJCRTSZW含药血清200 μL处理48小时 Pink1 inhibitor 20 nM和Pink1 mimics 2 μg处理细胞

摘要

目的:新加苁蓉菟丝子丸(XJCRTSZW)是一种补肾、养血、活血的传统中药复方。本研究旨在探讨XJCRTSZW对雷公藤甲素(TP)诱导的氧化应激损伤的作用。方法:成年雌性Sprague-Dawley大鼠和人卵巢颗粒细胞系用TP和XJCRTSZW处理。本研究进行了苏木精-伊红染色、酶联免疫吸附测定、流式细胞术、CCK-8、JC-1染色、透射电子显微镜、逆转录-定量聚合酶链反应和蛋白质印迹。结果:XJCRTSZW治疗明显改善了TP诱导的病理症状。此外,XJCRTSZW治疗明显增强了TP诱导的雌二醇、抗苗勒管激素、孕酮、超氧化物歧化酶、ATP含量、线粒体膜电位、p62和Hsp60 mRNA和蛋白水平的降低,在体内和体外(p < 0.05)。然而,TP诱导的卵泡刺激素和黄体生成素浓度升高、丙二醛水平、活性氧水平、凋亡率、线粒体自噬以及LC3-II/LC3-I、PTEN诱导激酶1(PINK1)和Parkin的mRNA和蛋白表达均降低(p < 0.05)。此外,XJCRTSZW治疗在体外显著提高了细胞活力(p < 0.05)。结论:XJCRTSZW通过线粒体自噬介导的PINK1/Parkin通路保护TP诱导的大鼠免受氧化应激损伤。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
XJCRTSZW是否通过线粒体自噬介导的PINK1/Parkin信号通路保护TP诱导的氧化应激损伤?
核心机制
XJCRTSZW通过促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,清除受损线粒体,减轻氧化应激损伤。
主要证据
体内外实验中,XJCRTSZW升高SOD、ATP、MMP、LC3-II/LC3-I、PINK1和Parkin水平,降低MDA、ROS、凋亡率和p62水平;PINK1敲低或过表达分别减弱或增强这些效应。
研究意义
为治疗生殖毒性(如POF和PCOS)提供新见解和方法。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立TP诱导的体内生殖毒性模型

验证TP能否诱导大鼠卵巢损伤和氧化应激

成年雌性SD大鼠随机分为6组(n=5),TP组连续灌胃400 μg/kg/d TP(含5% DMSO的盐水)30天,对照组给予等量盐水,随后不同组分别给予XJCRTSZW(高、中、低剂量)或EV处理两周。

2

病理与激素水平检测

评估XJCRTSZW对TP诱导的卵巢病理损伤和内分泌紊乱的改善作用

卵巢组织进行H&E染色,计数初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡;ELISA检测血清E2、AMH、FSH、LH水平。

3

氧化应激指标检测

评估XJCRTSZW对TP诱导的氧化应激水平的影响

检测GC中SOD、MDA、ROS水平。

4

凋亡检测

评估XJCRTSZW对TP诱导的颗粒细胞凋亡的影响

GC用Annexin V-APC和PI染色,流式细胞术分析凋亡率。

5

线粒体自噬和功能检测

评估XJCRTSZW对TP诱导的线粒体损伤和自噬的影响

透射电镜观察线粒体形态和自噬体;ELISA检测ATP;JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP);RT-qPCR和Western blot检测LC3、p62、Hsp60、PINK1和Parkin的表达。

6

体外细胞模型验证

在体外验证XJCRTSZW对TP诱导的颗粒细胞损伤的保护作用及PINK1的作用

人卵巢颗粒细胞系分为8组,TP处理6小时,然后加入含药血清、Pink1抑制剂或模拟物处理48小时;检测细胞活力、激素分泌、氧化应激、凋亡、线粒体自噬和PINK1/Parkin通路蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Sprague-Dawley大鼠Chengdu Dashuo Biological Technology Co., Ltd.--
人卵巢颗粒细胞系ProcellCP-H192
人卵巢颗粒细胞完全培养基ProcellCM-H192
RiboFect™ CP转染试剂盒RibobioC10511-05
CCK-8试剂盒Dojindo Laboratories--
雌二醇ELISA试剂盒BeyotimePE223
大鼠AMH ELISA试剂盒YbscienceYB-AMH-Ra
大鼠FSH ELISA试剂盒YbscienceXY-FSH-Ra
大鼠LH ELISA试剂盒YbscienceXY-LH-Ra
大鼠孕酮ELISA试剂盒Kemin BiologyKB3091
大鼠ATP ELISA试剂盒Qingqi Biology--
脂质过氧化MDA检测试剂盒BeyotimeS0131M
总超氧化物歧化酶检测试剂盒(NBT法)BeyotimeS0109
Annexin V-APCSigma Aldrich--
碘化丙啶Sigma Aldrich--
流式细胞仪BD FACSVerse--
活性氧检测试剂盒BeyotimeS0033
JC-1染料Molecular Probes--
激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM 710 META
透射电子显微镜JEM-1400PLUS--
TRIzol试剂TaKaRa Biotechnology Co., Ltd.--
Bio-Rad Scrip™ cDNA合成试剂盒Bio-Rad Laboratories, Inc.--
SYBR主混合物MedChemexpress--
总蛋白提取试剂盒SolarbioBC3711
蛋白测定试剂盒Beyotime--
聚偏二氟乙烯膜Millipore--
山羊抗兔IgG(H+L)-HRPAbcamab6721
电化学发光试剂盒EMD MilliporeWBULS0500
兔抗LC3II/I抗体Abcamab128025
兔抗p62抗体Abcamab56416
兔多克隆PINK1抗体Abcamab23707
兔多克隆Parkin抗体Abcamab15494
兔多克隆Hsp60抗体Abcamab46798
兔抗β-actin抗体Abcamab8227

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物分组与给药
大鼠品系、年龄、体重;TP溶剂和剂量;XJCRTSZW剂量和给药时间;EV给药方案;对照组处理
阅读提示:Methods: Experimental groups and drug administration
细胞培养与处理
细胞系来源和编号;培养基;TP浓度和处理时间;含药血清体积;Pink1抑制剂和mimics浓度
阅读提示:Methods: Cell culture, Cell transfection, Experimental groups and drug administration
氧化应激检测
SOD、MDA检测试剂盒型号;ROS检测试剂盒和流式细胞仪设置
阅读提示:Methods: Biochemical detection, Flow cytometric assay
线粒体自噬评估
透射电镜固定和染色步骤;JC-1染色浓度和孵育时间;ATP和MMP检测方法
阅读提示:Methods: JC-1 staining, Transmission electron microscopy
蛋白和mRNA表达
Western blot抗体和稀释比例;RT-qPCR引物和内参
阅读提示:Methods: Western blot assay, Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction