ECM蛋白动态变化的蛋白质组学分析
鉴定小鼠出生后肺泡发育过程中ECM成分的变化模式
对出生后P1、P4、P7、P14的小鼠肺组织进行TMT蛋白质组学分析，筛选出高表达ECM蛋白，并通过Western blot验证TN-C表达趋势。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Tenascin-C调节支气管肺发育不良中的肺泡化过程
Tenascin-C modulates alveolarization in bronchopulmonary dysplasia.
实验完整度
高包含体外细胞实验、基因敲除小鼠模型、抗体阻断治疗和多组学分析等多个独立证据层级，且有明确的功能和机制验证。
主要模型
MLE-12小鼠肺泡上皮细胞 BEAS-2B人支气管上皮细胞 C57BL/6J新生小鼠BPD模型（85%氧气） TN-C基因敲除小鼠BPD模型
重点核对
BPD模型：新生小鼠出生后12小时内暴露于85%氧气7天，然后常氧饲养至P14 TN-C敲除小鼠用于验证基因缺失对BPD发展的影响 TN-C中和抗体处理：P2、P4、P6、P8、P10腹腔注射1 μg/g体重 体外高氧处理：85%氧气处理24小时 sTN-C浓度：低剂量2 ng/mL，高剂量8 ng/mL
摘要
支气管肺发育不良（BPD）是一种以肺泡化延迟为特征的慢性肺部疾病。Tenascin-C（TN-C）是一种细胞外基质糖蛋白和可溶性分子，参与组织形态发生。在本研究中，我们证明了在85%氧气诱导的BPD小鼠模型中，肺组织中TN-C的水平升高。然而，TN-C缺乏会损害高氧诱导的BPD模型中的肺泡化。相反，功能性TN-C阻断抗体改善了BPD样小鼠的肺泡发育不良。机制上，高氧增加了呼吸道上皮细胞释放的可溶性TN-C（sTN-C）。一方面，低剂量sTN-C通过ICAM-1介导促进肺上皮细胞增殖和迁移。另一方面，高剂量sTN-C阻碍了上皮细胞的增殖和迁移。总之，这项研究揭示了TN-C在肺肺泡化中发挥双重作用，且TN-C可能是BPD治疗的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TN-C及其可溶形式sTN-C在出生后肺泡化和BPD发病中的作用和机制是什么？
- 核心机制
- 高氧通过HIF-1α促进呼吸道上皮细胞分泌sTN-C；低剂量sTN-C通过ICAM-1介导促进肺泡上皮细胞增殖和迁移，而高剂量sTN-C则抑制这些过程，表明TN-C在肺泡化中发挥双重作用。
- 主要证据
- 体外实验显示低剂量sTN-C促进MLE-12和BEAS-2B细胞增殖和迁移，高剂量则抑制；TN-C敲除加重高氧诱导的肺泡发育障碍；抗TN-C抗体改善BPD小鼠肺泡结构。
- 研究意义
- 研究表明TN-C是BPD治疗的潜在靶点，但需注意其双重作用，调节TN-C的平衡可能对治疗至关重要。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BPD模型中TN-C表达异常检测
评估BPD小鼠肺组织中TN-C蛋白表达水平的变化
建立新生小鼠BPD模型（85%氧气暴露7天），通过Western blot、ELISA和免疫组化检测TN-C表达。
高氧促进上皮细胞释放sTN-C的机制研究
探究高氧诱导上皮细胞分泌sTN-C的分子机制
用85%氧气处理MLE-12和BEAS-2B细胞，检测sTN-C分泌；通过HIF-1α激动剂和抑制剂处理细胞，分析HIF-1α对TN-C表达的影响。
sTN-C对上皮细胞功能的影响
验证sTN-C对肺泡上皮细胞增殖和迁移的作用
用低剂量（2 ng/mL）或高剂量（8 ng/mL）sTN-C处理MLE-12和BEAS-2B细胞，进行CCK-8、EdU和细胞迁移实验。
转录组分析及机制探索
寻找sTN-C促进上皮细胞增殖的潜在信号通路
用低剂量sTN-C处理MLE-12细胞后提取RNA进行转录组测序，KEGG富集分析发现AGE-RAGE通路，并验证ICAM-1表达变化。
TN-C缺乏对BPD发展的影响
评估TN-C缺失对高氧诱导的BPD模型的影响
使用TN-C敲除小鼠建立BPD模型，组织学评估肺泡化参数。
抗TN-C抗体治疗效果评估
验证中和TN-C是否能改善BPD小鼠的肺泡发育
对BPD模型小鼠腹腔注射TN-C中和抗体或同型对照，组织学评估肺泡发育和标志物表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学 | 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| TMT同位素标签 | Thermo Scientific | -- | |
| UltiMate 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive HFX Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Lonsera | -- | |
| 青霉素/链霉素 | HyClone | -- | |
| 支气管上皮细胞生长培养基 | Lonza | CC-3170 | |
| 药物处理 | 2-甲氧基雌二醇 | MCE | -- |
| 二甲基乙二酰甘氨酸 | MCE | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体转染试剂 | Yeasen | -- |
| 编码TN-C的表达质粒 | Vector Builder | -- | |
| 细胞增殖检测 | Cell-Light™ EdU Apollo®567细胞追踪试剂盒 | RiboBio | -- |
| TN-C中和抗体 | R&D Systems | MAB2138 | |
| CCK-8细胞计数试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| Western blot | 抗TN-C抗体 | Abcam | ab108930 |
| 抗HIF-1α抗体 | Abcam | ab179483 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Servicebio | GB15003 | |
| 抗RAGE抗体 | Abcam | ab216329 | |
| 抗SFTPC抗体 | Proteintech | 10774-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Servicebio | GB15004 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | EarthOx Life Sciences | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) HRP | Affinity Biosciences | s0002 | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| G:Box凝胶成像系统 | Syngene | -- | |
| 丽春红S | Beyotime | P0022 | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂 | -- | -- |
| 数字组织切片扫描仪 | 3DHistech | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂盒 | Life Technologies | -- |
| TRIzol试剂盒 | Vazyme | -- | |
| RT-qPCR | qPCR cDNA合成预混液 | Yeasen | 11141 |
| Universal Blue SYBR预混液 | Yeasen | 11184 | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 | ABI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BPD模型建立 | 新生小鼠（C57BL/6J）出生后12小时内暴露于85%氧气7天，然后常氧至P14；温度22°C，湿度50-60%；母鼠每48小时轮换。 阅读提示：Methods: Animal model of BPD |
| TN-C敲除实验 | TN-C敲除小鼠（C57BL/6J背景）暴露于85%氧气P1-P7，然后常氧至P14；对照组为野生型。 阅读提示：Methods: Animal model of BPD; Figure 6 |
| 抗体处理 | P2、P4、P6、P8、P10腹腔注射TN-C中和抗体或同型大鼠IgG，1 μg/g体重，溶于10 μl PBS。 阅读提示：Methods: Animal model of BPD |
| 细胞高氧暴露 | MLE-12和BEAS-2B细胞暴露于85%氧气24小时；对照组为21%氧气。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatments |
| sTN-C处理 | 使用293T细胞过表达TN-C获得含sTN-C上清；低剂量2 ng/mL，高剂量8 ng/mL；处理时间24小时。 阅读提示：Methods: Cell proliferation and viability assay; Figure 4 and 7 |