可控自催化裂解介导的荧光恢复用于人类癌细胞中烷基腺嘌呤DNA糖基化酶的均相传感

DNA烷基化和氧化是两种最常见的细胞毒性损伤形式，具有致突变和致癌的特性。人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶（hAAG）是已知唯一能修复多种烷基化和氧化DNA损伤的糖基化酶。然而，很少有方法能够实时监测hAAG活性。方法：在此，我们开发了一种简便的荧光策略，基于可控自催化裂解介导的荧光恢复，用于均相、灵敏地检测hAAG活性。hAAG的存在使发夹探针1（HP1）在受损的2′-脱氧肌苷位点被AP核酸内切酶1（APE1）切割，形成DNA双链体。所得DNA双链体中内置的触发物1可与发夹探针2（HP2）杂交，诱导T7外切酶（T7 exo）催化的HP2循环切割（循环I）释放触发物2。触发物2可进一步与信号探针（在其5′和3′端分别修饰荧光团（FAM）和淬灭剂（BHQ1））杂交，诱导随后的信号探针循环切割（循环II）释放FAM分子。通过两次循环的自催化裂解过程，大量荧光团分子（即FAM）从FAM-BHQ1荧光共振能量转移（FRET）对中释放出来，导致放大荧光恢复。结果：利用体内DNA修复机制的高准确性、T7外切酶催化单核苷酸水解的高特异性以及自催化循环扩增的高效率，该策略表现出高灵敏度，检测限为4.9×10⁻⁶ U/μL，动态范围大，达4个数量级（1×10⁻⁵至0.1 U/μL），并能进一步准确评估酶动力学参数、筛选潜在抑制剂，甚至可从1个癌细胞中定量hAAG活性。结论：所提出的策略可为监测DNA损伤相关修复酶提供一个简便且通用的平台，在DNA修复相关的生化研究、临床诊断、药物发现和癌症治疗方面具有巨大潜力。